一种定量检测血清中维生素B12的方法及预处理试剂盒技术

本发明专利技术涉及微量化合物检测技术领域，具体涉及一种定量检测血清中维生素B12的方法及预处理试剂盒。检测方法包括：采用甲醇和异丙醇沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本进行预处理；配制氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的对照品溶液；将预处理后的血清样本和配制的对照品溶液进行HPLC－MS/MS检测，所述甲醇和异丙醇混合溶液为甲醇：异丙醇体积比为9:1的混合溶液。本发明专利技术实施方式中建立的HPLC－MS/MS测定血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺浓度的方法，检测灵敏度高，检出限低，准确度好，可用于临床上VB12家族的浓度监测，更真实的反映人血清中维生素B12含量，在药物浓度监测方面，能更清晰准确的辅助指导用药。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测血清中维生素B12的方法及预处理试剂盒
本专利技术涉及微量化合物检测
，具体涉及一种定量检测血清中维生素B12的方法及预处理试剂盒。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。维生素B12又叫钴胺素，是唯一一类含有金属元素的维生素，自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12是需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的惟一的一种维生素。有的人由于肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。植物性食物中基本上没有维生素B12.它在肠道内停留时间长，大约需要三小时(大多数水溶性维生素只需要几秒钟)才能被吸收。维生素B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。维生素B12的家族成员主要包括：氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲钴胺。它们在临床应用中，也有不同的意义。(1)氰钴胺氰钴胺需在体内转化为甲钴胺和腺苷钴胺后起效，其稳定性最好，在体内的吸收速度也位居四者之首，虽然它不能被人体直接利用，但它的功效决不亚于直接使用腺苷钴胺。(2)甲钴胺甲钴胺在人体内的吸收速度仅次于氰钴胺，它对神经组织具有良好的传递性，可促进核酸-蛋白-脂肪代谢，修复受损的神经组织，在临床上对有糖尿病引起的神经障碍、多发性神经炎等周围神经病，尤其对麻木、疼痛和麻痹有明显的疗效。在治疗周围神经病变方面，甲钴胺临床应用的安全性及疗效均优于腺苷钴胺和氰钴胺。《2013糖尿病周围神经病变诊断和治疗共识》推荐补充B族维生素可以改善糖尿病神经病变，针对神经营养修复治疗推荐甲钴胺作为辅助治疗。(3)羟钴胺羟钴胺的水溶性较好，在尿中的代谢速度慢，故被称长效钴胺素。虽然其吸收速度不及氰钴胺和甲钴胺，但是它在眼部能达到较高浓度，有利于缓解视觉疲劳并营养视神经，因此它对烟草中毒性弱视有一定的疗效。此外，羟钴胺在水溶液中能够快速与游离的氰根结合生成无毒的氰钴胺，因此它已被多个国家批准用于已知或疑似氰化物中毒的治疗。(4)腺苷钴胺腺苷钴胺在国际上被用作生化试剂和试验试剂，目前只有中国药典把它收载为药品。腺苷钴胺在中国市场上已经应用多年，作用与其它家族成员基本相同。参考书有将腺苷钴胺划分为血液系统用药，它除用于治疗巨幼红细胞性贫血外还可用于营养不良性贫血、妊娠期贫血及放射线和化疗药物引起的白细胞减少症等。腺苷钴胺可以提高体内血红蛋白含量，改善贫血，疗效明显。血清维生素B12的测定是最直接的鉴定方法。目前血清检测方法主要有化学发光法、液相色谱-串联质谱法、液相色谱-电感耦合等离子体法等。其中液相色谱-串联质谱法只单一检测VB12家族中的氰钴胺，并没有同时检测VB12家族的四重物质，目前市面上应用的化学发光法可测定维生素B12家族，其应用原理是酶联免疫。液相色谱-电感耦合等离子体法也可检测维生素B12家族，其原理是检测维生素B12家族所含的钴元素。而应用液相色谱-串联质谱法目前只单一检测VB12家族中的氰钴胺，有一定的片面性，无法真实反映人体内VB12含量。有专利技术将甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺转化为氰钴胺去检测总VB12，其方法并没有对VB12家族的其他成员进行直接定量，未考虑转化为氰钴胺时转化效率的问题，会导致定量不准确。且转化过程使用的氰化物有剧毒，不适合作为常规的检测方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术建立了一种高效液相色谱－质谱联用法(HPLC－MS/MS)测定血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺浓度的方法，可用于临床上VB12家族的浓度监测，更真实的反映人血清中维生素B12含量，在药物浓度监测方面，能更清晰准确的辅助指导用药，分别对氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺进行定量可更直观的调节药物用量及评价不同药物的疗效。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下所述：在本专利技术的第一方面，提供一种定量检测血清中维生素B12的方法，所述方法包括：采用甲醇和异丙醇沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本进行预处理；配制氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的对照品溶液；将预处理后的血清样本和配制的对照品溶液进行HPLC－MS/MS检测。专利技术人发现采用HPLC－MS/MS检测人体内VB12含量时，只单一检测VB12家族中的氰钴胺有一定的片面性，无法真实反映人体内VB12含量；而将甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺转化为氰钴胺去检测总VB12的方法未考虑转化为氰钴胺时转化效率的问题，还会导致定量不准确。本专利技术首次提供了一种通过高效液相色谱-串联质谱法检测维生素B12家族浓度的方法，可对血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺进行药物浓度检测，也可用该指标反映人体内维生素B12的营养状况，解决了质谱法单一检测氰钴胺代表维生素B12的片面性。本专利技术需要克服的技术难点有两个，其一是由于VB12家族在人体里含量低，难检测，专利技术人对比了几种蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等方法，综合四种物质的提取效率，最终选择甲醇和异丙醇混合溶液沉淀、氮吹复溶的方法提取，使其能满足检测要求；其二是由于VB12家族结构相似，断裂后的子离子碎片大小相同，母离子大小也很接近，为了避免在质谱上互相干扰，需要将四种物质在液相上分开，在尝试了几种不同的色谱柱、流动相组成以及调节液相梯度后，最终将四种物质分开。本专利技术建立的HPLC－MS/MS测定血清中氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺浓度的方法，可用于临床上VB12家族的浓度监测，更真实的反映人血清中维生素B12含量，在药物浓度监测方面，能更清晰准确的辅助指导用药。将血清提取后，用质谱扫描氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的离子对，对其进行浓度定量，检测灵敏度高，检出限低，准确度好。在本专利技术的第二方面，提供一种检测血清中维生素B12的预处理试剂盒，所述试剂盒包括甲醇和异丙醇混合溶液。本专利技术的具体实施方式具有以下有益效果：解决了现有技术中应用液相色谱-串联质谱法检测人体内VB12含量时只单一检测VB12家族中的氰钴胺，有一定的片面性，无法真实反映人体内VB12含量的问题，定量更加准确。且检测过程中不使用有剧毒的氰化物，检测方法更加安全；分别对氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺进行定量分析，在监测血液药物浓度来指导用药方面能够更直观的调节药物用量及评价不同药物的疗效；通过对血清样本的预处理解决VB12家族在人体里含量低，难检测的问题，通过甲醇和异丙醇混合溶液沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本中的VB12进行提取，使其能满足检测要求；VB12家族结构相似，断裂后的子离子碎片大小相同，母离子大小也很接近，本专利技术的实施方式通过对色谱柱、流动相组成以及调节液相梯度，将氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺四种物质分开，避免在质谱上互相干扰；本专利技术实施方式中建立的HPLC－MS/M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测血清中维生素B12的方法，其特征在于，所述方法包括：/n采用甲醇和异丙醇沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本进行预处理；配制氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的对照品溶液；/n将预处理后的血清样本和配制的对照品溶液进行HPLC－MS/MS检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种定量检测血清中维生素B12的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用甲醇和异丙醇沉淀、氮吹复溶的方法对血清样本进行预处理；配制氰钴胺、甲钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺的对照品溶液；
将预处理后的血清样本和配制的对照品溶液进行HPLC－MS/MS检测。


2.如权利要求1所述的定量检测血清中维生素B12的方法，其特征在于，血清样本预处理的步骤为：
取血清样品加入内标溶液后再加入甲醇和异丙醇混合溶液，上清溶液用氮气吹干，用甲醇溶液复溶，复溶后转入进样板，进行HPLC－MS/MS分析。


3.如权利要求2所述的定量检测血清中维生素B12的方法，其特征在于，所述内标溶液为氰钴胺－d7溶液。


4.如权利要求2所述的定量检测血清中维生素B12的方法，其特征在于，所述甲醇和异丙醇混合溶液为甲醇：异丙醇体积比为8～10:1的混合溶液；优选的，所述体积比为9:1。


5.如权利要求2所述的定量检测血清中维生素B12的方法，其特征在于，所述甲醇溶液为体积百分数为40-60％的甲醇水溶液。


6.如权利要求1所述的定量检测血清中维生素B12的方法，其特征在于，对照品溶液的配制...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振，景叶松，弭兆元，
申请(专利权)人：山东英盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37