一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒技术

本发明专利技术首次提供一种一次性检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒，由对照品、质控品、同位素内标提取液、增强剂、提取溶剂、流动相添加剂A、流动相添加剂B、96孔反应板、96孔过滤板、说明书组成。本试剂盒可以同时检测乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ‑丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺，用时较短，提高了检测的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒
本专利技术属于检测领域，具体涉及一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒。
技术介绍
心血管疾病目前是中国城乡居民死亡原因的首位，高于肿瘤和其他疾病。最新发布的《中国心血管病报告2018》数据表明：中国心血管病患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，推算全国有心血管病患者2.9亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺心病500万，心力衰竭45万，风心病250万，高血压2.7亿。中国30％的人口存在≥3个心血管危险因素，即近4亿人口同时存在≥3个心血管危险因素。我国心血管病防治工作已取得初步成效但仍面临严峻挑战。总体上看，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。心血管病死亡占城乡居民疾病死亡构成的40％以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题，在政府发布的《中国慢性病防治工作规划》中就明确指出：慢病防治最关键的部分就在于提高疾病的风险预测，即做到早发现、早治疗。氧化三甲胺(TMAO)是由肠道细菌消化红肉、鸡蛋、乳制品、咸水鱼后，再经过肝脏加工产生的一种极性小分子化合物。随着肠道菌群研究的深入，科学家们发现TMAO与心血管疾病、脑卒中、糖尿病、慢性肾病、癌症等多种疾病密切相关，因此TMAO越来越受到广泛关注。TMAO是一个新型的预测心脑血管及代谢疾病风险的生物标记物，能很好的独立预测心脑血管及代谢疾病的风险。近年来，科学家们陆续发现TMAO相关的最初代谢物和其他中间前体也显示是心脑血管及代谢疾病风险的标志。然而，目前的检测方法虽然也用液质联用仪方法，但只能检测其中一个或少量几个指标，不能一次性联检全部指标。因此，本领域迫切需要开放一种分析时间短、灵敏、准确且能够同时定量检测多种肠道微生物代谢物(例如例如乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺)的检测试剂盒及检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种分析时间短、灵敏、准确且能够同时定量检测多种肠道微生物代谢物(例如乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺)的检测试剂盒及检测方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，包括：(1)质控品，所述质控品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；(2)同位素内标提取液，所述同位素内标提取液含有乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇；(3)增强剂，所述增强剂包括组分(a)溴乙酸叔丁酯和乙腈；和组分(b)碳酸钠；(4)提取溶剂，所述提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸；(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；以及(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水。在另一优选例中，同位素内标提取液中，乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇的浓度相同。在另一优选例中，在所述增强剂的所述组分(a)中，溴乙酸叔丁酯的浓度为25-45mmol/L。在另一优选例中，在所述增强剂的所述组分(b)中，碳酸钠的浓度为0.1-0.5mol/L，较佳地，0.2-0.4mol/L。在另一优选例中，所述提取溶剂中，所述组分(ii)的体积比(v/v)为1.0-3.0％，较佳地1.5-2.5％。在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的部件：96孔反应板、说明书。在另一优选例中，所述检测试剂盒还包括(7)对照品，所述对照品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐和三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。本专利技术第二方面提供了一种通过高效液相色谱质谱联用法测定所取的生物样品中一种或多种肠道微生物代谢物的量的方法，包括：(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行电离，分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的至少一种前体离子；(ii)分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子；和(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种肠道微生物代谢物的量；其中，色谱检测过程中的流动相中加入甲酸和氨水。在另一优选例中，所述质谱为串联质谱。在另一优选例中，所述一种或多种肠道微生物代谢物包括乙酰左旋肉碱，且其中所述乙酰左旋肉碱的所述母离子的质/荷比为204.00＞85.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括甜菜碱醛，且其中所述甜菜碱醛的所述母离子的质/荷比为101.95＞58.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括甜菜碱，且其中所述甜菜碱的所述母离子的质/荷比为118.10＞58.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括氯化胆碱，且其中所述氯化胆碱的所述母离子的质/荷比为104.15＞58.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括盐酸巴豆甜菜碱，且其中所述盐酸巴豆甜菜碱的所述母离子的质/荷比为144.00＞58.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括γ-丁基甜菜碱，且其中所述γ-丁基甜菜碱的所述母离子的质/荷比为146.00＞87.05；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括左旋肉碱，且其中所述左旋肉碱的所述母离子的质/荷比为162.10＞60.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括三甲胺盐酸盐，且其中所述三甲胺盐酸盐的所述母离子的质/荷比为174.10＞59.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括三甲基赖氨酸，且其中所述三甲基赖氨酸的所述母离子的质/荷比为189.20＞84.10；和/或所述一种或多种肠道微生物代谢物包括氧化三甲胺，且其中所述氧化三甲胺的所述母离子的质/荷比为76.15＞58.15。在另一优选例中，所述方法还包括：在通过电喷雾离子源(ESI)对所述一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行电离前，用溴乙酸叔丁酯和碳酸钠对一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行衍生处理。在另一优选例中，色谱检测过程中，所述液相色谱具有下述一个或多色谱条件：(i)流动相包括流动相A和流动相B；其中，流动相A为含流动相添加剂A和流动相添加剂B的水；流动相B为含流动相添加剂A的乙腈；(ii)色谱柱柱温为25-50℃，较佳地35-45℃；(iii)进样室温度为2-20℃，较佳地5-15℃；(iv)流速本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，其特征在于，包括：/n(1)质控品，所述质控品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；/n(2)同位素内标提取液，所述同位素内标提取液含有乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇；/n(3)增强剂，所述增强剂包括组分(a)溴乙酸叔丁酯和乙腈；和组分(b)碳酸钠；/n(4)提取溶剂，所述提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸；/n(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；以及/n(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)质控品，所述质控品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；
(2)同位素内标提取液，所述同位素内标提取液含有乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇；
(3)增强剂，所述增强剂包括组分(a)溴乙酸叔丁酯和乙腈；和组分(b)碳酸钠；
(4)提取溶剂，所述提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸；
(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；以及
(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述增强剂的所述组分(a)中，溴乙酸叔丁酯的浓度为25-45mmol/L。


3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述增强剂的所述组分(b)中，碳酸钠的浓度为0.1-0.5mol/L，较佳地，0.2-0.4mol/L。


4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述提取溶剂中，所述组分(ii)的体积比(v/v)为1.0-3.0％，较佳地1.5-2.5％。


5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括(7)对照品，所述对照品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐和三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。


6.一种通过高效液相色谱质谱联用法测定所取的生物样品中一种或多种肠道微生物代谢物的量的方法，其特征在于，包括：
(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行电离，分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的至少一种前体离子；
(ii)分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子；和
(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种肠道微生物代谢物的量；
其中，色谱检测过程中的流动相中加入甲酸和氨水。


7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质谱为串联质谱。

【专利技术属性】
技术研发人员：詹红，铃木亨，霍志远，孔志霞，蔡洪玉，
申请(专利权)人：上海透景生命科技股份有限公司，上海透景诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31