一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体及其制备方法和应用技术

一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体及其制备方法和应用，本发明专利技术涉及生物医药技术领域，为突变体TpeRha‑R369A、突变体TpeRha‑W512A和突变体TpeRha‑K579A中的任一种；所述突变体TpeRha‑R369A，为将氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的TpeRha酶的第369位的精氨酸突变为丙氨酸；所述突变体TpeRha‑W512A，为将氨基酸序列为所述TpeRha酶的第512位的色氨酸突变为丙氨酸。本发明专利技术通过定点突变技术构建α‑L‑鼠李糖苷酶TpeRha的组合突变体，催化转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物，酶解时间短，转化率高。

【技术实现步骤摘要】
一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
淫羊藿是小檗科淫羊藿属植物，是我国药典收载的传统中药，具有益精气、坚筋骨、补腰膝、强心力等功效，其主要活性成分是含有2-3个糖基的淫羊藿黄酮苷，淫羊藿黄酮苷具有抗癌、抗骨质疏松、抗衰老、免疫调节功能和补肾阳作用等功效。大量研究显示，朝藿定C、淫羊藿苷等淫羊藿黄酮原生苷在小肠吸收较差，其主要是以肠道代谢产物（次级苷或苷元）的形式被吸收而发挥疗效。因此，对淫羊藿黄酮苷进行稳定可控的水解，实现淫羊藿黄酮苷的有效生物转化，对于加强药物合成、增加生物利用度以提高药效发挥上具有重要意义。淫羊藿次苷Ⅰ是淫羊藿黄酮次级苷中的高活性物质，其通过菌群调节展示了潜在的增强宿主免疫功能和抗癌活性，具备很好的抗癌药物开发前景。但是，淫羊藿次苷Ⅰ在淫羊藿中含量极低，随着其活性功能不断被挖掘，其市场需求将越来越大。传统植物提取方法因其含量极低，后期纯化难度高，而淫羊藿提取物中含量相对较高是原生苷，如朝藿定C（占淫羊藿总黄酮的20.8%）和淫羊藿苷（占淫羊藿总黄酮的21.9%），以原生苷作为前体物质，利用α-L-鼠李糖苷酶进行淫羊藿次苷Ⅰ的制备是目前最有效的制备方法。α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC3.2.1.40）是一类具有广阔应用前景的糖苷水解酶，在植物、动物和微生物中广泛存在，能够将以醇羟基和半缩醛反应形成的糖苷键以外切或内切的方式断裂，在生物体中糖缀合物以及糖的合成和水解的过程中起到很重要的作用。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药等行业都具有广泛的应用价值，已有大量报道其可以有效地定向水解含有鼠李糖苷的天然活性物质或天然药物，如人参皂苷、柚皮苷、橙皮苷和芦丁等，提高原有物质的生物活性和生物利用度，是工业生产中常用的水解酶类。然而，α-L-鼠李糖苷酶在进行规模化应用时仍然存在较大的技术壁垒，天然的α-L-鼠李糖苷酶活力不足，且其反应环境往往难以满足天然酶的最优条件。随着分子生物学、基因工程等相关技术逐渐成熟，对蛋白序列进行编辑与修改，可以加强酶催化机理的解读以及指导酶的设计。蛋白质工程理性设计是以定点突变技术为主要手段，根据对蛋白质结构与功能关系地了解，有目的地设计改造蛋白质，使其性能达到预期效果。目前，已有大量研究成功利用理性设计技术对天然酶的催化活性、底物特异性、热稳定性以及酶的别构效应等进行改造。然而，理性设计方法需要对酶的三维结构以及结构与功能的相互关系有较深入的了解。随着计算生物学的发展，计算机辅助设计指导酶改造的方法日趋成熟。利用计算机模拟的方法，建立酶的三维结构模型，分析酶与底物的构象关系，快速定位与催化反应相关的区域，缩小突变库容量，高效获得相关靶点，为蛋白质工程改造提供指导。专利号为CN201710448315.6，名称为一种糖苷酶组合物及酶法制备淫羊藿苷元的方法的中国专利，其通过α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成制备淫羊藿苷元，具有较高淫羊藿苷元转化率，但是其中的淫羊藿次苷Ⅰ含量未知。专利号为CN201710332977.7，名称为一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法，由耐热α-L-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶组成的双酶体系协同转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷生成淫羊藿苷元，也无法高效催化转化得到淫羊藿次苷Ⅰ。因此，采用定点突变技术对α-L-鼠李糖苷酶TpeRha进行理性设计获得具备水解淫羊藿苷生成淫羊藿次苷Ⅰ的高效的鼠李糖苷酶TpeRha突变体是一个具备意义的研究方向。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体，用于制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物，转化率高。本专利技术的目的之二在于提供一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体在制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物中的应用。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体，为突变体TpeRha-R369A、突变体TpeRha-W512A和突变体TpeRha-K579A中的任一种；所述突变体TpeRha-R369A，为将氨基酸序列为如SEQIDNO：1所示的TpeRha酶的第369位的精氨酸突变为丙氨酸；所述突变体TpeRha-W512A，为将氨基酸序列为如SEQIDNO：1所示的TpeRha酶的第512位的色氨酸突变为丙氨酸；所述突变体TpeRha-K579A，为将氨基酸序列为如SEQIDNO：1所示的TpeRha酶的第579位的赖氨酸突变为丙氨酸。进一步地，所述突变体TpeRha-R369A的氨基酸序列为如SEQIDNO：3所示；所述突变体TpeRha-W512A的氨基酸序列为如SEQIDNO：5所示；所述突变体TpeRha-K579A的氨基酸序列为如SEQIDNO：7所示。进一步地，编码所述突变体TpeRha-R369A基因的核苷酸序列为如SEQIDNO：4所示；编码所述突变体TpeRha-W512A基因的核苷酸序列为如SEQIDNO：6所示；编码所述突变体TpeRha-K579A基因的核苷酸序列为如SEQIDNO：8所示。进一步地，所述TpeRha酶来源于石油热袍菌DSM13995。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体的制备方法，包括以下步骤：S1，将TpeRha酶基因连接到质粒中，得到重组质粒；S2，设计突变引物，采用突变引物并以所述重组质粒为模板进行PCR扩增，酶切消化去除模板DNA，得到突变产物；S3，将突变产物转化至宿主细胞中，筛选得到鼠李糖苷酶TpeRha突变体表达菌株，诱导表达，得到鼠李糖苷酶TpeRha突变体。进一步地，所述TpeRha酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。进一步地，突变引物序列如SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：22和SEQIDNO：23所示。进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体在制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物中的应用。进一步地，利用鼠李糖苷酶TpeRha突变体催化转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术的一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体，通过定点突变技术构建α-L-鼠李糖苷酶TpeRha的组合突变体，催化转化淫羊藿总黄酮中的多组分黄酮糖苷制备淫羊藿次苷Ⅰ组合物，酶解时间短，转化率高。其中，突变体TpeRha-R369A在55℃，pH4.6的反应体系中水解淫羊藿苷制备淫羊藿次苷Ⅰ的效率比野生型TpeRha提高了8.41倍；突变体TpeRha-W512A在55℃，pH4.6的反应体系中水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体，其特征在于，为突变体TpeRha-R369A、突变体TpeRha-W512A 和突变体TpeRha-K579A中的任一种；/n所述突变体TpeRha-R369A，为将氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的TpeRha酶的第369位的精氨酸突变为丙氨酸；/n所述突变体TpeRha-W512A，为将氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的TpeRha酶的第512位的色氨酸突变为丙氨酸；/n所述突变体TpeRha-K579A，为将氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示的TpeRha酶的第579位的赖氨酸突变为丙氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体，其特征在于，为突变体TpeRha-R369A、突变体TpeRha-W512A和突变体TpeRha-K579A中的任一种；
所述突变体TpeRha-R369A，为将氨基酸序列为如SEQIDNO：1所示的TpeRha酶的第369位的精氨酸突变为丙氨酸；
所述突变体TpeRha-W512A，为将氨基酸序列为如SEQIDNO：1所示的TpeRha酶的第512位的色氨酸突变为丙氨酸；
所述突变体TpeRha-K579A，为将氨基酸序列为如SEQIDNO：1所示的TpeRha酶的第579位的赖氨酸突变为丙氨酸。


2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体，其特征在于，所述突变体TpeRha-R369A的氨基酸序列为如SEQIDNO：3所示；
所述突变体TpeRha-W512A的氨基酸序列为如SEQIDNO：5所示；
所述突变体TpeRha-K579A的氨基酸序列为如SEQIDNO：7所示。


3.根据权利要求2所述的一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体，其特征在于，编码所述突变体TpeRha-R369A基因的核苷酸序列为如SEQIDNO：4所示；
编码所述突变体TpeRha-W512A基因的核苷酸序列为如SEQIDNO：6所示；
编码所述突变体TpeRha-K579A基因的核苷酸序列为如SEQIDNO：8所示。


4.根据权利要求1所述的一种鼠李糖苷酶TpeRha突变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄佳俊，李慧灵，胡浩轩，林育成，卢宇靖，周金林，
申请(专利权)人：广东金骏康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44