低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G制造技术

本发明专利技术公开了一种低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G，该突变体MutS117G具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutS117G的热活性和热稳定性发生了改变，突变酶MutS117G的低温活性变高但热稳定性变差。纯化的野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，而突变酶MutS117G的最适温度为25℃；50℃处理后，野生酶InuAMN8的酶活从88％降至81％，而突变酶MutS117G的酶活从87％降至58％；55℃处理后，野生酶InuAMN8的酶活剩余70％，而突变酶则完全失活。本发明专利技术的突变体MutS117G可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。

【技术实现步骤摘要】
低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G
本专利技术涉及一种外切菊粉酶突变体，具体涉及一种低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G。
技术介绍
菊芋适合在贫瘠坡地、干旱盐碱的非耕边际土地上种植，不与农作物争耕地，具有产量高、耐寒、耐贫瘠及耐干旱等优点。菊粉是构成菊芋块茎的主要成分，可占其湿重的19％或干重的70％。外切菊粉酶可降解菊粉，生成果糖和少部分的葡萄糖，该果糖浆中果糖含量可达到总糖量的95％。果糖广泛用于食品、医药、生物能源等行业。例如，果糖可作为天然甜味剂替代蔗糖；果糖代谢不受胰岛素的制约，可以供糖尿病患者食用；果糖经酵母等发酵后可以用来生产生物乙醇。因而，外切菊粉酶可应用于食品、酿酒和生物能源等行业中(SinghRSetal.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2017,96:312–322)。在一些实际的应用中，需要低温环境，例如低温下的食品处理可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，清酒和葡萄酒的发酵、水产养殖环境、洗涤、污水处理通常在低温下进行；此外，低温处理还可降低能耗(Cavicchiolietal.MicrobialBiotechnology,2011,4(4):449–460)。因此，低温酶具有重要的开发价值。低温外切菊粉酶可用于酒的发酵、食品的腌制、去污、低温下的菊粉水解制备高浓度果糖浆等(Zhouetal.JournalofBioscienceandBioengineering,2015,119(3):267–274)。低温外切菊粉酶在实际应用中具有独特的优势，如在低温环境下具有高的催化活性，节能的同时也节约了成本，简单的热处理就可以使酶失活，操作简便又有效。因此，获得在低温环境下具有更高活性且更容易热处理的外切菊粉酶突变体，即最适温度和热稳定性降低的外切菊粉酶突变体，将更有利于酶的实际应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G，该突变酶MutS117G的热活性和热稳定性发生了改变，突变酶MutS117G的低温活性变高但热稳定性变差，能够应用于食品、酿酒和洗涤等行业。为了达到上述目的，本专利技术提供了低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G，该突变体MutS117G具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。与GenBank记录的外切菊粉酶序列AGC01505(SEQIDNO.3)相比，MutS117G的第117位氨基酸为甘氨酸，而AGC01505的第117位氨基酸为丝氨酸。本专利技术的突变体MutS117G，最适温度为25℃，在0℃、10℃、20℃和35℃时分别具有24％、53％、91％和86％的酶活；50℃处理10–60min后，MutS117G的酶活从87％降至58％；55℃处理10min后，MutS117G完全失活；该酶可水解菊粉产生果糖。本专利技术的另一目的是提供所述的突变体MutS117G的编码基因mutS117G。优选地，该编码基因mutS117G具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的另一目的是提供包含所述的编码基因mutS117G的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含所述的编码基因mutS117G的重组菌。本专利技术的另一目的是提供所述的突变体MutS117G的制备方法，该方法包含：将具有如SEQIDNO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含mutS117G的重组表达质粒pEasy-E1-mutS117G；将重组表达质粒pEasy-E1-mutS117G转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含mutS117G的重组菌株；培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶突变体MutS117G表达，以获得重组外切菊粉酶突变体MutS117G。优选地，所述包含mutS117G的重组菌株的制备为，将所述重组表达质粒pEasy-E1-mutS117G经DpnI酶消化，利用MutIIFastMutagenesisKit试剂盒将消化产物进行连接，再通过热激方式转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。优选地，所述诱导采用IPTG进行诱导。优选地，所述重组外切菊粉酶突变体MutS117G表达的产物经Nickel-NTAAgarose和0–500mM的咪唑分别亲和和纯化，获得重组外切菊粉酶突变体MutS117G。本专利技术的另一目的是提供所述的突变体MutS117G在食品、酿酒及洗涤中的应用。本专利技术的低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G，具有以下优点：与野生酶InuAMN8相比，突变酶MutS117G的热活性和热稳定性发生了改变，突变酶MutS117G的低温活性变高但热稳定性变差，最适温度降低且更容易热变性，在低温环境下具有更高的催化活性，并有利于通过温度变化控制酶的催化反应。纯化的野生酶InuAMN8的最适温度为35℃，在0℃、10℃、20℃和25℃时分别具有15％、32％、58％和74％的酶活，而突变酶MutS117G的最适温度为25℃，在0℃、10℃、20℃和35℃时分别具有24％、53％、91％和86％的酶活；50℃处理10–60min后，野生酶InuAMN8的酶活从88％降至81％，而突变酶MutS117G的酶活从87％降至58％；55℃处理10min后，野生酶InuAMN8的酶活剩余70％，而突变酶则完全失活。本专利技术的低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G可应用于食品、酿酒和洗涤等行业。附图说明图1为野生酶InuAMN8和突变酶MutS117G的SDS-PAGE分析。图2为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutS117G的热活性。图3为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutS117G在50℃时的稳定性。图4为纯化的野生酶InuAMN8和突变酶MutS117G在55℃时的稳定性。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例中的实验材料和试剂：1、菌株及载体大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E1可购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobactersp.)由云南师范大学提供，保藏于云南省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为YMF4.00006。2、酶类及其它生化试剂Nickel-NTAAgarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及MutI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G，其特征在于，该突变体MutS117G具有如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G，其特征在于，该突变体MutS117G具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的突变体MutS117G的编码基因mutS117G。


3.根据权利要求2所述的编码基因mutS117G，其特征在于，该编码基因mutS117G具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。


4.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutS117G的重组载体。


5.包含如权利要求2或3所述的编码基因mutS117G的重组菌。


6.如权利要求1所述的突变体MutS117G的制备方法，其特征在于，该方法包含：
将具有如SEQIDNO.4所示核苷酸序列的野生外切菊粉酶基因inuAMN8和表达载体pEasy-E1相连接，获得包含inuAMN8的重组表达质粒pEasy-E1-inuAMN8；
以质粒pEasy-E1-inuAMN8为模板，以如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示核苷酸序列的突变引物，通过PCR扩增得到包含mutS117G的重组表达质...

【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，张蕊，黄遵锡，岑潇龙，唐湘华，许波，李俊俊，韩楠玉，吴倩，高艳秀，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53