本发明专利技术涉及一种耐热性β‑甘露聚糖酶突变体ManAK‑2及其编码基因和应用，属于基因工程和酶工程领域，所述突变体是在野生β‑甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示基础上进行的突变，所述的突变位点选自G331C、S158Y、Q166W、S177R、S180I、K99W、N178R、N178I、D273C/V308C或N277C/T315C中的一种。本发明专利技术突变体的耐热稳定性提高，且基本保持了野生β‑甘露聚糖酶ManAK的的广泛pH和最适温度。
【技术实现步骤摘要】
一种耐热性β-甘露聚糖酶突变体ManAK-2及其编码基因和应用
本专利技术属于基因工程和酶工程领域，特别涉及一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体ManAK-2及其编码基因和应用。
技术介绍
甘露聚糖是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于自然界中，它是多种植物细胞壁的主要组成成分，作为植物性饲料原料被视为一种抗营养因子。由于甘露聚糖的多样性与结构的复杂性，它的完全水解需要多种酶的协同作用才能完成，包括内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、乙酞甘露聚糖酯酶和α-半乳糖苷酶等。其中，内切-β-甘露聚糖酶能够降解甘露聚糖主链的β-1，4-糖苷键，是甘露聚糖降解过程中发挥最重要作用的酶。β-甘露聚糖酶(β-mannanase,EC3.2.1.78)主要来源于细菌、真菌和放线菌等微生物，目前，应用于工业生产β-甘露聚糖酶的菌种多为曲霉、芽抱杆菌、酵母等，在食品、医药、饲料等领域有广泛的应用。β-甘露聚糖酶在饲料工业中作为一种饲料添加剂，能有效地降解饲料中的甘露聚糖，提高动物对饲料的消化能力。目前饲料添加剂用酶都需要经过高温制粒，制备能够耐高温、耐酸、具有对消化酶耐受性提高的β-甘露聚糖酶，对于β-甘露聚糖酶在饲用酶和工业化应用具有重要价值。野生型的β-甘露聚糖酶基因经过异源表达和理性设计后已经能够获得较好的酶学性质，对于提高现有的β-甘露聚糖酶的耐高温性能发挥着至关重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体，在饲料及其他领域具有更为良好的应用潜力。具体而言，本专利技术针对前期开发的耐热酸性β-甘露聚糖酶ManAK进行必要的理性设计，改良酶学特性。ManAK最适反应pH为2，且当pH在2.0-6.0范围内具有较好的稳定性。最适作用温度为75℃，在60℃高温下30min可保持83％的酶活。然而，作为饲料添加剂应用，其耐热性和酶活力还有待进一步提高。为了提高ManAK耐热性能，本专利技术对该酶的空间结构进行分子模拟对接分析，通过分析分子内二硫键，将该酶进行单位点和双位点突变，得到的突变体的最适温度(Topt)和t1/2都有改变，耐热性能提高。一种耐热性β-甘露聚糖酶突变体，是在野生β-甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示基础上进行的突变，所述的突变位点选自G331C、S158Y、Q166W、S177R、S180I、K99W、N178R、N178I、D273C/V308C或N277C/T315C中的一种。本专利技术的再一目的是提供编码上述突变体的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株，所述重组菌株为毕赤酵母X33。本专利技术还提供所述突变体在饲料或饲料添加剂中的应用。本专利技术还提供含有所述突变体的饲料或饲料添加剂。本专利技术还提供所述重组菌株在饲料或饲料添加剂中的应用。本专利技术还提供所述重组载体在饲料或饲料添加剂中的应用。根据本专利技术的技术方案，野生β-甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1：TALPKASPAPSSSSSSSSSASTSFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDDSDVDLVMSHLKSSGLKILRVWGFNDVTTQPSSGTVWYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAEQHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSDETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYDWIEKTSKFIKGLDADHMVCIGDEGFGLNTDSDGSYPYQFAEGLNFTKNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWGNGWISAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNHCSVESPWQKTALNTTGVSADLFWQYGDDLSTGKSPDDGNTIYYGTSDYECLVTDHVAAIGSA野生β-甘露聚糖酶ManAK的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2：actgctttgccaaaggcttctccagctccatcttcttcttcttcttcctcttcttctgcttctacttcttttgcttctacttctggtttgcaatttactattgatggtgaaactggttactttgctggtactaactcttactggattggttttcttactgatgattctgatgttgatttggttatgtctcatttgaagtcttctggtttgaagattttgagagtttggggttttaacgatgttactactcaaccatcttctggtactgtttggtaccaattgcatcaagatggtaagtctactattaacactggtgctgatggtttgcaaagattggattacgttgtttcttctgctgaacaacatgatattaagttgattattaactttgttaactactggactgattacggtggtatgtctgcttacgtttctgcttacggtggttctgatgaaactgatttttacacttctgatactatgcaatctgcttaccaaacttacattaagactgttgttgaaagatactctaactcttctgctgtttttgcttgggaattggctaacgaaccaagatgtccatcttgtgatacttctgttttgtacgattggattgaaaagacttctaagtttattaagggtttggatgctgatcatatggtttgtattggtgatgaaggttttggtttgaacactgattctgatggttcttacccataccaatttgctgaaggtttgaactttactaagaacttgggtattgatactattgattttggtactttgcatttgtacccagattcttggggtacttctgatgattggggtaacggttggatttctgctcatggtgctgcttgtaaggctgctggtaagccatgtttgttggaagaatacggtgttacttctaaccattgttctgttgaatctccatggcaaaagactgctttgaacactactggtgtttctgctgatttgttttggcaatacggtgatgatttgtctactggtaagtctccagatgatggtaacactatttactacggtacttctgattacgaatgtttggttactgatcatgttgctgctattggttctgcttaa所述的点突变G331C为甘露聚糖酶突变体ManAK-1(G331C)，由氨基酸序列为SEQIDNO.1的甘露聚糖酶的第331位氨基酸甘氨酸(G)变为半胱氨酸(C)获得。所述的点本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种耐热性β-甘露聚糖酶突变体ManAK-2，其特征在于所述突变体是在野生β-甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示基础上进行的突变，所述的突变位点为S158Y。/n
【技术特征摘要】
1.一种耐热性β-甘露聚糖酶突变体ManAK-2，其特征在于所述突变体是在野生β-甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示基础上进行的突变，所述的突变位点为S158Y。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.包含编码权利要求1所述突变体基因的重组载体。
4.包含编码权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，刘哲民，苑明雪，张芳，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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