重组几丁聚糖水解酵素及其用于制造几丁寡糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组几丁聚糖水解酵素，包含如序列辨识编号(SEQ ID NO)：1至6所示序列的任一者的氨基酸序列。几丁聚糖经前述重组几丁聚糖水解酵素水解后可提升水解产物中几丁二糖及/或几丁三糖的比例。

【技术实现步骤摘要】
重组几丁聚糖水解酵素及其用于制造几丁寡糖的方法
本专利技术涉及一种几丁聚糖水解酵素，尤其涉及一种芽孢杆菌的重组几丁聚糖水解酵素。
技术介绍
几丁质(chitin)广泛存在节肢动物的外骨骼，例如虾壳、蟹壳、乌贼软骨及真菌的细胞壁中，是由N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)以β-1,4糖苷键所聚合而成的天然聚合物。几丁质是地球上产量仅次于纤维素与木质素的生物质，但由于几丁质结构排列紧密而不溶于水，不利于人们利用，所以过去常被认定为是废弃物。不过，近来的研究发现几丁质的衍生物具有较高的溶解度，使几丁质可被加以利用而不再被视为废弃物，其中，几丁质去乙酰化后的产物几丁聚糖(chitosan)在酸性环境下能溶于水中，大幅提升可被利用的程度，因此被广泛应用到多种产业及商品上，例如保养品、保健食品、药物、生医器材及农业等。几丁寡糖(chito-oligosaccharides)是几丁聚糖的水解产物，且几丁寡糖是由2至20个葡萄糖胺单体所键结而成的。几丁寡糖具有小于几丁聚糖的分子量(约数百至数千)，且具有相对于几丁聚糖较佳的水溶性。目前已知几丁寡糖可活化植物体中的抗病基因，使抗病基因大量表现，在植物防御系统中扮演举足轻重的角色。此外，几丁寡糖还具有多种生物活性，例如：降低胆固醇、抗微生物与提升免疫机能等，更有研究指出含有六个单体的几丁寡糖(几丁六糖)具有抗肿瘤细胞的功效。一般而言，制造几丁寡糖的方式主要有化学法、物理法及酵素法，其中物理法效率不高而化学法较便宜，所以目前市面上贩卖的几丁寡糖多为化学法水解的产物。但是以化学法进行水解不仅需要使用大量强酸及强碱，且水解的产物不具专一性，并以单糖为主要产物，不利于其他单一种几丁寡糖，如几丁二糖、几丁三糖的制造。反之，酵素法具有较高专一性，所以以酵素法水解几丁聚糖有较高的机会获得单一种几丁寡糖，以应用特定几丁寡糖的生物活性。然而，几丁聚糖水解酵素的水解产物仍包含多种几丁寡糖，故实有必要提供一种可生产单一种几丁寡糖的几丁聚糖水解酵素。
技术实现思路
本专利技术的一态样在于提供一种重组几丁聚糖水解酵素，其水解产物包含以几丁二糖及/或几丁三糖为主的几丁寡糖。本专利技术的另一态样在于提供一种几丁寡糖的制造方法，其利用上述重组几丁聚糖水解酵素水解几丁聚糖水溶液，以获得以几丁二糖及/或几丁三糖为主的水解产物。根据本专利技术的上述态样，提出一种重组几丁聚糖水解酵素，包含如序列辨识编号(SEQIDNO)：1至6所示序列的任一者的氨基酸序列。在一实施例中，前述重组几丁聚糖水解酵素水解的水解产物可包含几丁寡糖，其中几丁寡糖可包含几丁二糖及/或几丁三糖，且前述几丁二糖及/或几丁三糖于几丁寡糖的含量可例如为至少60％。在另一实施例中，前述SEQIDNO：1及2所示序列的重组几丁聚糖水解酵素的水解产物包含几丁三糖。在又一实施例中，前述SEQIDNO：3至6所示序列的重组几丁聚糖水解酵素的水解产物包含几丁二糖。在再一实施例中，前述重组几丁聚糖水解酵素可例如内切型酵素。在再一实施例中，前述重组几丁聚糖水解酵素在酸碱值pH4到7之间具有至少60％的酵素活性。根据本专利技术的另一态样，提出一种几丁寡糖的制造方法，包含提供几丁聚糖水溶液，并利用如SEQIDNO：1至6所示序列的任一者的重组几丁聚糖水解酵素水解前述几丁聚糖水溶液，以获得水解产物。接着，进行沉淀步骤，以由前述水解产物获得几丁寡糖，其中几丁寡糖包含几丁二糖及/或几丁三糖。在一实施例中，前述如SEQIDNO：1及2所示序列的任一者的重组几丁聚糖水解酵素的水解产物包含几丁三糖。在一实施例中，前述SEQIDNO：3至6所示序列的任一者的重组几丁聚糖水解酵素的水解产物包含几丁二糖。在一实施例中，前述重组几丁聚糖水解酵素在pH4到7之间具有至少70％的酵素活性。应用本专利技术的重组几丁聚糖水解酵素，可生产以几丁二糖及/或几丁三糖为主的几丁寡糖，以降低后续纯化程序与成本而增加可应用性。附图说明为让本专利技术的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下：图1为pET20b-csn-TI的质粒图谱。图2A与图2B分别为第一粗萃酵素(图2A)与第二粗萃酵素(图2B)的SDS-PAGE电泳图。图3显示各种几丁聚糖水解酵素的水解产物。图4为各种几丁聚糖水解酵素水解几丁聚糖24小时后的产物比例柱形图。图5A与图5B分别表示野生型酵素BWT(图5A)与突变型酵素TI-D(图5B)的酸碱耐受性。图6A与图6B分别表示野生型酵素BWT(图6A)与突变型酵素TI-D(图6B)经不同酸碱值处理后酵素溶液中可溶性蛋白质的相对含量。图7A与图7B分别显示于不同pH值下野生型酵素BWT(图7A)与突变型酵素TI-D(图7B)的活性。图8A与图8B分别表示野生型酵素BWT(图8A)与突变型酵素TI-D(图8B)于不同温度的耐受性。图9A与图9B分别表示野生型酵素BWT(图9A)与突变型酵素TI-D(图9B)不同温度下的活性。图10A与图10B分别表示野生型酵素BWT(图10A)与突变型酵素TI-D(图10B)长时间作用后水解产物以TLC分析的结果。图11为野生型酵素BWT与突变型酵素TI-D的水解型式图。图12A至图12D分别表示突变型酵素TI-D开口状态的示意图(图12A)、闭口状态的示意图(图12B)、开口状态表面电子云图(图12C)以及闭口状态表面电子云图(图12D)。图13为几丁聚糖水解酵素BWT与基质结合模拟图。图14为几丁聚糖水解酵素TI-D与基质结合模拟图。图15为几丁聚糖水解酵素TI-D水解基质产生几丁二糖与几丁四糖或几丁三糖的模拟示意图。图16为几丁聚糖水解酵素TI-D水解基质产生几丁二糖与几丁四糖的模拟示意图。图17A与图17B分别为野生型酵素BWT(图17A)与突变型酵素TI-D(图17B)不同反应时间的几丁寡糖摩尔浓度变化。图18为纯化产物的冻干粉末的寡糖分析结果。图19显示纯化产物的几丁二糖、几丁三糖与几丁四糖的比例。其中，附图标记：111/113/171/173/175：曲线401/403/405/407/191/193/195：直条具体实施方式本专利技术提供一种重组几丁聚糖水解酵素，可生产以几丁二糖及/或几丁三糖为主的几丁寡糖。在一实施例中，重组几丁聚糖水解酵素是以芽孢杆菌MH-K1几丁聚糖水解酵素(SEQIDNO:7)为模板，改变部分的序列，从而形成的突变型酵素(或称重组几丁聚糖水解酵素)。前述重组几丁聚糖水解酵素可包含第一突变区(由SEQIDNO:7中第74个至第78个氨基酸序列改变而成)与位于基质结合位内的第二突变区(由SEQIDNO:7第175～176个氨基酸序列改变而成)，借此改变野生型酵素的立体结构及/或与几丁聚糖的亲和力，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组几丁聚糖水解酵素，其特征在于，包含如序列辨识编号(SEQ ID NO)：1至6所示序列的任一者的一氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组几丁聚糖水解酵素，其特征在于，包含如序列辨识编号(SEQIDNO)：1至6所示序列的任一者的一氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的重组几丁聚糖水解酵素，其特征在于，该重组几丁聚糖水解酵素水解的一水解产物包含几丁寡糖，该几丁寡糖包含几丁二糖及/或几丁三糖，且该几丁二糖及/或该几丁三糖于该几丁寡糖的含量为至少60％。


3.根据权利要求1所述的重组几丁聚糖水解酵素，其特征在于，SEQIDNO：1及2所示序列的该重组几丁聚糖水解酵素的该水解产物包含该几丁三糖。


4.根据权利要求1所述的重组几丁聚糖水解酵素，其特征在于，SEQIDNO：3至6所示序列的该重组几丁聚糖水解酵素的该水解产物包含该几丁二糖。


5.根据权利要求1所述的重组几丁聚糖水解酵素，其特征在于，该重组几丁聚糖水解酵素是一内切型酵素。


6.根据权利要求1所述的重组几丁聚糖水解酵素，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑至玉，王麒颔，柳佩君，蔡嘉煌，
申请(专利权)人：高雄科技大学，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71