采用近红外光谱-偏最小二乘法定量检测DNA碱基的方法技术

采用近红外光谱－偏最小二乘法定量检测ＤＮＡ碱基的方法属于近红外光谱检测技术领域。现有高效液相色谱法其检测设备昂贵，费用较高，操作较复杂，试验耗时较长，试验数据变异较大。本发明专利技术采用近红外光谱－偏最小二乘法检测ＤＮＡ四种碱基的含量，第一步检测ＤＮＡ碱基混合物的近红外漫反射光谱。第二步用偏最小二乘法分析所检测到的近红外漫反射光谱。即采用偏最小二乘法建立ＤＮＡ碱基定量分析模型，首先采用一阶导数光谱法对所测得的红外漫反射光谱进行光谱预处理；然后采用交互检验法选择最佳主成分数，用预测残差平方和作为评价标准验证；用所述的定量分析模型对参加建模的每个样品进行预测，求出每个样品的预测值和已知参考值的差。本发明专利技术可用于ＤＮＡ碱基的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种近红外光谱(NIR)法与偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)相结合定量检测DNA碱基的方法，属于近红外光谱检测

技术介绍
腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)是DNA的重要组成部分，对其分离和分析方法较多，目前普遍采用的是高效液相色谱法(HPLC)。该方法根据试样组分在色谱柱中的流动相(淋洗液)和固定相之间的分配系数不同实现DNA碱基的分离和分析。当试样随着流动相进入色谱柱中后，组分就在其中的两相间进行反复多次(103～106)地分配，即吸附-脱附-放出。由于固定相对各种组分的吸附能力不同，即保存作用不同，因此，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰，从而得到各组分的含量。高效液相色谱法具有速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。近红外光谱波长分布在1100～2500nm内，近红外光谱法是测定样品中复杂化学成分的方法。其光谱特性稳定，具有样品前处理简捷、无需化学试剂、环保、操作简单、检测速度快、稳定性好及可实现在线分析等优点。在该方法中，近红外光谱的产生，主要是由于分子振动的非谐振性。在近红外光谱范围内，测量含氢基团X-H(X＝C、N、O、S等)振动的倍频及合频吸收。由于倍频和合频跃迁几率低，而有机物质在近红外光谱区为倍频与合频吸收，所以消光系数弱，谱带重叠严重。因此，从近红外光谱中提取的有用信息属于弱信息和多元信息，通常借助于化学计量学方法如偏最小二乘法完成定性定量分析。
技术实现思路
现有技术中的高效液相色谱法其检测设备昂贵，费用较高，操作较复杂，试验耗时较长，试验数据变异较大。而目前尚未见到近红外光谱法与偏最小二乘法相结合定量检测DNA碱基的报道。本专利技术的目的是以近红外光谱法与偏最小二乘法相结合的方法取代高效液相色谱法，快速、简便定量检测DNA碱基，为此，我们专利技术了一种采用近红外光谱-偏最小二乘法定量检测DNA碱基的方法。本专利技术之方法的特征在于，采用近红外光谱-偏最小二乘法检测DNA四种碱基的含量，其步骤如下：1、检测DNA碱基混合物的近红外漫反射光谱对样品进行近红外扫描，扫描波长范围为1100～2500nm；2、用偏最小二乘法分析所检测到的近红外漫反射光谱-->(1)采用偏最小二乘法建立DNA碱基定量分析模型，即：首先采用一阶导数光谱法对所测得的红外漫反射光潜进行光谱预处理；然后，采用交互检验法选择最佳主成分数，用预测残差平方和(PRESS)作为评价标准验证；(2)用所述的定量分析模型对参加建模的每个样品进行预测，求出每个样品的预测值和已知参考值的差。本专利技术其技术效果在于，建立DNA碱基定量分析模型，因而不需要对样品进行化学处理，其预测精度能够满足检测微量样品的定量分析的要求，以及检测速度快、操作简单。所测得的红外漫反射光谱重叠严重，采用通常的光谱分析方法难以进行定量分析，而采用偏最小二乘法则可以实现分析。最佳主成分数的选择直接关系到DNA碱基定量分析模型的实际预测能力，主成分数过少，就不能充分反映样品光谱信息，主成分数过多则会将一些噪音的信息也掺入计算，降低模型的预测能力，而采用交互检验法，用预测残差平方和(PRESS)作为评价标准，确定了所需的最佳主成分数。附图说明图1是四种DNA碱基混合物的预处理原始光谱。图2是四种DNA碱基混合物的预处理光谱一阶导数曲线图，该图兼作为摘要附图。图3是腺嘌呤主成分数与PLS定量分析模型PRESS值的关系图。图4是胸腺嘧啶主成分数与PLS定量分析模型PRESS值的关系图。图5是鸟嘌呤主成分数与PLS定量分析模型PRESS值的关系图。图6是胞嘧啶主成分数与PLS定量分析模型PRESS值的关系图。图7是腺嘌呤标准浓度与预测浓度对应关系校正集曲线图。图8是腺嘌呤标准浓度与预报浓度对应关系预测集曲线图。图9是胸腺嘧啶标准浓度与预测浓度对应关系校正集曲线图。图10是胸腺嘧啶标准浓度与预测浓度对应关系预测集曲线图。图11是鸟嘌呤标准浓度与预测浓度对应关系校正集曲线图。图12是鸟嘌呤标准浓度与预测浓度对应关系预测集曲线图。图13是胞嘧啶标准浓度与预测浓度对应关系校正集曲线图。图14是胞嘧啶标准浓度与预测浓度对应关系预测集曲线图。具体实施方式四种DNA碱基混合物样品的配制，将按不同浓度配比的35个四种DNA碱基混合物样品随机分成两组，一组为校正集(the calibration set)，包括30个四种DNA碱基混合物样品，另一组为预测集(the prediction set)，包括5个四种DNA碱基混合物样品。根据配方计算得出35个样品的标准浓度值。采用近红外光谱-偏最小二乘法检测四种DNA碱基的含量，其步骤如下：1、检测DNA碱基混合物的近红外漫反射光谱将碱基混合物样品压片于积分球的样品槽中，采用岛津UV-3100型紫外可见近红外分光光度计对样品进行近红外扫描，光谱带宽12nm，中速扫描，扫描波长范围为1100～2500nm，每个样品扫描3次，取平均值。所测得的四种DNA碱基混合物的近红外漫反射光谱见图1、-->图2所示。2、用偏最小二乘法分析所检测到的近红外漫反射光谱(1)采用偏最小二乘法建立DNA碱基定量分析模型，即：首先采用一阶导数光谱法对所测得的红外漫反射光谱进行光谱预处理；然后，采用交互检验法选择最佳主成分数，用预测残差平方和(PRESS)作为评价标准验证；(2)用所述的定量分析模型对参加建模的每个样品进行预测，求出每个样品的预测值和已知参考值的差。PRESS的数学表达式为：PRESS=Σi=1nΣj=1d(rp,ij-rij)2]]>式中：n是校正集中样品数目；d是建立模型使用的主成分数；rp，ij是样品的预测值；rij是样品的参考值。最佳主成分数的确定：采用偏最小二乘法建立DNA碱基定量分析模型时，主成分数的选择直接关系到DNA碱基定量分析模型的实际预测能力，主成分数过少，就不能充分反应样品光谱信息；主成分数过多则会将一些噪音的信息也掺入计算，降低模型的预测能力。当PRESS值越小，说明模型的预测能力越强，所选主成分数为最佳。当所选光谱所对应的四种碱基主成分数均为4时，模型有最小的PRESS值；当主成分数继续增加时，PRESS值呈现上升趋势，见图3～6所示，从而导致模型预测能力下降，因此，样品的最佳主成分数为4。方法可靠性确定：最佳主成分数确定以后，用样品一阶导数光谱数据建立的最佳DNA碱基定量分析模型，用该模型预报四种碱基的校正集和预测集样品浓度，四种碱基的校正集和预测集的近红外光谱预测浓度和标准浓度的线性关系见图7～14所示，求得预测值和标准值使用的参数及相对标准误差(RSD)列于下表中，由此可知该方法可靠。-->本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用近红外光谱－偏最小二乘法定量检测ＤＮＡ碱基的方法，其特征在于，采用近红外光谱－偏最小二乘法检测ＤＮＡ四种碱基的含量，其步骤如下：　第一步，检测ＤＮＡ碱基混合物的近红外漫反射光谱，对样品进行近红外扫描，扫描波长范围为１１００～２ ５００ｎｍ；　第二步，用偏最小二乘法分析所检测到的近红外漫反射光谱：　（１）采用偏最小二乘法建立ＤＮＡ碱基定量分析模型，即：首先采用一阶导数光谱法对所测得的红外漫反射光谱进行光谱预处理；然后，采用交互检验法选择最佳主成分数，用预 测残差平方和（ＰＲＥＳＳ）作为评价标准验证；　（２）用所述的定量分析模型对参加建模的每个样品进行预测，求出每个样品的预测值和已知参考值的差。

【技术特征摘要】
1、一种采用近红外光谱-偏最小二乘法定量检测DNA碱基的方法，其特征在于，采用近红外光谱-偏最小二乘法检测DNA四种碱基的含量，其步骤如下：第一步，检测DNA碱基混合物的近红外漫反射光谱，对样品进行近红外扫描，扫描波长范围为1100～2500nm；第二步，用偏最小二乘法分析所检测到的近红外漫反射光谱：(1)采用偏最小二乘法建立DNA碱基定量分析模型，即：首先采用一阶导数光谱法对所测得的红外漫反射光谱进行光谱预处理；然后，采用交互检验法选择最佳主成分数，用预测残差平方和(PRESS)作为评价标准验证；(2)用所述的定量分析模型对参加建模的每个样品进行预测，求出每个样品的预测值和已知参考值的差。2、根据权利要求1所述的定量检...

【专利技术属性】
技术研发人员：田坚，金丽虹，赵丽辉，申炳俊，王一郎，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]