一种法尼基转移酶变体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种法尼基转移酶变体及其制备方法，本发明专利技术筛选出一种法尼基转移酶蛋白序列，将其基因通过密码子优化后，通过大肠杆菌表达体系进行高密度发酵诱导表达，表达量高；进一步提供了无需经过变形性和复性的可溶性表达方法，并且纯化步骤简单方便；通过特异性酶活性检测该制备的法尼基转移酶具有很强的酶活力，为蛋白偶联提供一种可工业化生产的工具酶。工具酶。

【技术实现步骤摘要】
一种法尼基转移酶变体及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种法尼基转移酶变体及其制备方法。

技术介绍

[0002]法尼基转移酶(Farnesyl Transferase，FTase)由两个亚基组成：一个48kDa的α亚基和一个46kDa的β亚基，两个亚基主要由α螺旋组成。α亚基由双层平行堆叠的成对α螺旋构成，其围绕β亚基部分包裹，就像毯子一样。β亚基的α螺旋形成一个桶。活性位点由β亚基的中心形成，α亚基的一部分侧接在β亚基的中心(如图5)。
[0003]FTase可催化以下化学反应：
[0004]法尼基二磷酸盐+蛋白质-半胱氨酸S-法尼基蛋白+二磷酸
[0005]该酶具有用于法尼基二磷酸酯(脂质供体分子)的疏水结合口袋，主要向目标蛋白质的羧基末端带有CaaX四个氨基酸序列的部位加法尼基(十五碳类异戊二烯基团)。其中：C是异戊烯基化的半胱氨酸，a是任何脂肪族氨基酸，X是M，S，Q，A或C。目标蛋白质羧基末端半胱氨酸(C)中的-SH与法尼基形成硫醚键，CaaX基序的最后三个氨基酸随后被去除，使翻译后的蛋白质完成法尼基化修饰。
[0006]蛋白药物的开发过程中，尤其是药物偶联抗体，往往在其蛋白序列的羧基末端加入CaaX基序。FTase可以识别抗体分子羧基末端的CaaX框，通过硫醚键将具有生物活性的小分子药物连接到抗体分子上，而抗体作为载体将小分子药物运输到靶细胞中。FTase作为定向偶联工具酶，解决了传统偶联技术中所得产品是有不同药物分子数的混合物且无法实现特定位置偶联的缺点。所以越来越多的学者和医药企业将开发FTase作为研发重点。
[0007]目前关于法尼基转移酶制备等相关研究的文献或专利非常少；本领域需要提供一种法尼基裂解酶的蛋白序列以及制备方法，可以实现其作为工具酶的应用价值。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的之一是提供一种法尼基转移酶变体。
[0009]本专利技术的目的之二是提供本专利技术所述的法尼基转移酶变体的制备方法。
[0010]本专利技术所述的目的通过以下方案实现：
[0011]本专利技术所述的法尼基转移酶变体，包括被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基。
[0012]本专利技术所述的法尼基转移酶变体的制备方法，是将被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基基因在大肠杆菌中可溶性表达和纯化，制备得到的法尼基转移酶可以应用于实验研究。
[0013]本专利技术具体的技术方案如下：
[0014]一种法尼基转移酶变体，包括被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基，其中，被修饰的法尼基转移酶α亚基序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3，A1为His标签，A2为EVDDDDK连接位点，A3为法尼基转移酶α亚基。
[0015]在一种实施例中，A1为3～8个His标签，在一种具体实施例中，A1为6个His标签，其
核苷酸序列为Seq ID No.3，氨基酸序列为Seq ID No.4。
[0016]在一种实施例中，A2为EVDDDDK连接位点，核苷酸序列为Seq ID No.5，氨基酸序列为Seq ID No.6。
[0017]在一种实施例中，A3为法尼基转移酶α亚基，核苷酸序列为Seq ID No.7，氨基酸序列为Seq ID No.8。
[0018]在一种实施例中，本专利技术所述的被修饰的法尼基转移酶α亚基核苷酸序列为Seq ID No.1，氨基酸序列为Seq ID No.2。
[0019]在一种实施例中，法尼基转移酶β亚基，核苷酸序列为Seq ID No.9，氨基酸序列为Seq ID No.10。
[0020]在一种实施例中，本专利技术所述的法尼基转移酶变体，所述变体的核苷酸序列包括Seq ID No.1和Seq ID No.9，氨基酸序列包括Seq ID No.2和Seq ID No.10。
[0021]本专利技术是采用大肠杆菌为宿主，为了增加宿主的表达效率，本专利技术将法尼基转移酶α亚基和β亚基及两者变体的核苷酸序列进行密码子偏好性优化。在本专利技术优选的实施方式中，编码所述的法尼基转移酶基因序列分别为Seq ID No.7和Seq ID No.9所示的核苷酸序列。
[0022]本专利技术进一步提供一类表达载体，包含编码所述的含被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基基因序列。该表达载体属于pETDuet类，含有两个多克隆酶切位点区域，可用于在大肠杆菌中同时表达两个目的基因。
[0023]为插入pETDuet中，在合成包含被修饰的的法尼基转移酶α亚基时，两端分别添加了NcoI/HindIII限制酶酶切位点。在合成法尼基转移酶β亚基时，两端分别添加了NdeI/XhoI限制酶酶切位点。将其插入质粒pETDuet的NcoI/HindIII和NdeI/XhoI酶切位点。
[0024]另外，本专利技术提供所述法尼基转移酶变体的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的可溶性表达方法，包括以下步骤：
[0025](1)高密度发酵法尼基转移酶变体；
[0026](2)收集菌体；
[0027](3)破碎菌体；
[0028](4)收集上清；
[0029](5)Ni
2+-NTA基质纯化上述法尼基转移酶变体；
[0030](6)离子交换纯化法尼基转移酶变体；
[0031](7)浓缩。
[0032]在一种实施例中，步骤(1)中高密度发酵所用的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，本专利技术的方法对大肠杆菌宿主的种类没有任何限制。优选那些能够直接表达构象正确目的蛋白的宿主。将前述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCL2转化法等。
[0033]在一种实施例中，步骤(1)中的高密度发酵可采用本领域技术人员所公知的诱导宿主表达蛋白的技术。
[0034]在本专利技术优选的实施方式中，步骤(1)中的高密度发酵法尼基转移酶在发酵1.5-5小时OD
600
为50-250进行诱导，诱导温度20-30℃。专利技术人发现采用该条件，可以使得目的蛋白获得更高效的表达。为了获得更高效的表达，进一步优选发酵3-5小时OD
600
为150-250进
行诱导。诱导可以采用本领域常规的方法，在一种实施例中，是采用终浓度为0.lmM至2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。
[0035]本专利技术步骤(1)中的高密度发酵法尼基转移酶可以采用本领域常用的培养基；为了获得更高效的表达，在一种实施例中，本专利技术的种子培养基和基础发酵罐培养基均采用葡萄糖或甘油作为碳源，更优选为甘油。
[0036]在一种实施例中，本专利技术提供一种可以提高表达的种子培养基，包含：12～15g/L胰蛋白胨(Typtone)，30～35g/L酵母提取物(Yeast Extraction)和4～6ml/L甘油。
[0037]在一种实施例中，本专利技术提供一种可以提高标的基础发酵罐培养基，包含：12～1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种法尼基转移酶变体，其特征在于，包括被修饰的法尼基转移酶α亚基和β亚基氨，其中，被修饰的法尼基转移酶α亚基序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3，A1为His标签，A2为EVDDDDK酶切位点，A3为法尼基转移酶α亚基。2.根据权利要求1所述的法尼基转移酶变体，其特征在于，A1为3～8个His标签，优选为6个His标签，核苷酸序列为Seq ID No.3，氨基酸序列为Seq ID No.4；A2为EVDDDDK酶切位点，核苷酸序列为Seq ID No.5，氨基酸序列为Seq ID No.6；A3为法尼基转移酶α亚基，核苷酸序列为Seq ID No.7，氨基酸序列为Seq ID No.8。3.根据权利要求1所述的法尼基转移酶变体，其特征在于，被修饰的法尼基转移酶α亚基核苷酸序列为Seq ID No.1，氨基酸序列为Seq ID No.2。4.根据权利要求1所述的法尼基转移酶变体，其特征在于，法尼基转移酶β亚基，核苷酸序列为Seq ID No.9，氨基酸序列为Seq ID No.10。5.根据权利要求1所述的法尼基转移酶变体，其特征在于，所述变体的核苷酸序列包括SeqID No.1和Seq ID No.9，氨基酸序列包括Seq ID No.2和Seq ID No.10。6.编...

【专利技术属性】
技术研发人员：文良柱，赵珊珊，王雪松，苗森，姜皓，容平芳，徐晓峰，支艳艳，李晓稳，
申请(专利权)人：上海复星医药产业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：