大麦HvHMT3基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了大麦HvHMT3基因及其在调控大麦对干旱胁迫耐受性方面的应用，属于基因工程技术领域。所述大麦HvHMT3基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过对大麦HvHMT3基因的克隆和分析，并结合过表达和RNAi技术在大麦GP上对该基因进行功能验证发现，HvHMT3过表达植株的耐旱性显著增强，而HvHMT3

【技术实现步骤摘要】
大麦HvHMT3基因及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及大麦HvHMT3基因及其在调控大麦对干旱胁迫耐受性方面的应用。

技术介绍

[0002]干旱是目前公认的严重制约农作物产量和品质的世界性问题(Zhou等，2018)。全球干旱、半干旱面积约占耕地面积的43％，而中国干旱、半干旱面积约占全国耕地面积的50％(赵璞等，2016)。干旱对农作物的损害仅次于病虫害，在所有非生物胁迫中居首位(唐益苗等，2009)。干旱胁迫正严重制约着农作物产量潜力的发挥。同时，水质污染进一步加剧了农作物灌溉缺水情况。因此，提高作物的耐/抗旱能力已经成为现代植物育种工作急需解决的关键问题之一。
[0003]植物的耐旱性或对干旱的适应能力是一个复杂的性状，涉及很多代谢途径和表型特征；同时，同一作物不同的基因型间可能拥有不同的干旱响应模式，因此解析植物的耐旱机制仍然是一个具有挑战性的任务(Hu和Xiong，2014；Fang等，2015)。
[0004]大麦是全球各地普遍栽培的第四大禾谷类作物。同时，大麦是二倍体自花授粉作物，其染色体数目少，可作为其它麦类作物的模式植物，十分适合生理和遗传机理研究(Forster等,2000)。然而，栽培大麦在长期的驯化过程中，特别是经过近代育种和集约化种植，遗传变异显著缩小，造成众多基因丢失，尤其是一些稀有的等位基因，对不良环境和病虫害的反应表现更为敏感。栽培大麦单调的遗传背景已成为取得突破性育种改良成效的瓶颈，而野生大麦丰富的遗传多样性可为打破这一瓶颈提供活的基因库(Ellis等，2000；Forster等，2000)。因此，发掘与利用野生大麦资源是显著改良大麦非生物胁迫耐性的有效途径。
[0005]青藏高原是大麦起源中心之一，大麦种质资源非常丰富，尤其是其所独有的一年生野生大麦，一直是国际大麦界所瞩目的珍贵野生资源；由于其独特的地形、气候、生态环境特点，形成了与之相适应的遗传控制系统(Nevo等，1997)，在非生物胁迫耐性上遗传多样性十分丰富，而且这些近缘野生大麦与栽培大麦的遗传距离较近，杂交完全可育，使其成为大麦育种的重要基因库，是适应性、抗逆性和产量育种的宝贵资源。因此从青藏高原一年生野生大麦中发掘优异的抗(耐)性相关基因，进而应用于栽培大麦或其他作物，对作物品种改良具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种从大麦中克隆得到的具有耐干旱胁迫特性的基因，为大麦耐干旱胁迫育种与生产提供了理论依据和相关基因。
[0007]为实现上述目的，本专利技术从青藏高原一年生野生大麦(Hordeum vulgare L.ssp.spontaneum)XZ5中鉴定克隆到具有耐干旱胁迫特性的基因HvHMT3，XZ5为本课题组前期筛选得到的青藏高原一年生六棱型野生大麦(耐干旱基因型，赵婧等)。
[0008]HvHMT3基因克隆与分析：以XZ5和XZ54(青藏高原一年生二棱型野生大麦，干旱敏感型，赵婧等)，及大麦品种Tadmor(国际公认的耐干旱大麦品种，Forster等，2004)为材料，PEG模拟干旱试验，比较分析了大麦根系miRNA及其靶基因响应干旱胁迫的基因型差异，鉴定到与XZ5耐旱性相关的候选miRNA(Novel
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m0521
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5p)及其靶基因MLOC_73965.1；高通量测序和qRT
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PCR验证结果表明，干旱胁迫下，非保守miRNA Novel
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m0521
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5p在XZ5中下调表达，但在XZ54和Tadmor中表达不变；而其靶基因MLOC_73965.1在XZ5中上调表达，在XZ54和Tadmor中表达不变。Novel
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m0521
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5p和MLOC_73965.1表达变化与miRNA调控靶基因的典型机制吻合。将靶基因MLOC_73965.1的核酸序列翻译成蛋白序列，在NCBI、Ensembl Plants和大麦数据库IPK中进行BLAST比对，结果显示该蛋白含有Homocysteine
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binding domain，被注释为同型半胱氨酸甲基转移酶(Homocysteine S
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methyltransferase,HMT)；基于隐马尔可夫模型和BLAST分析，在大麦基因组中共发现了3个HMT家族成员，分别位于大麦第3、4、5号染色体上，因此将位于5号染色体上的该基因命名为HvHMT3。
[0009]HvHMT3基因CDS区全长为1032bp。分别从三个大麦基因型XZ5、XZ54和Tadmor中克隆了HvHMT3基因的CDS序列，显示XZ5的序列中存在3个SNP(图1A)，其中1处为错义突变，使第164个氨基酸残基由精氨酸R变成了甘氨酸G(图1B)。
[0010]本专利技术还提供了所述的大麦HvHMT3基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]HvHMT3蛋白由343个氨基酸残基组成，该蛋白分子量为36.7kDa，等电点pI＝5.14。蛋白序列功能域预测分析显示，该蛋白含有1个功能域：同型半胱氨酸结合功能域(Homocysteine
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binding domain)，其中包含3个锌结合位点(图2、3)。该蛋白与玉米的ZmHMT1和水稻的OsHMT4序列相似度最高，相似度分别为82.86％和84.20％(图3、4)。将HvHMT3蛋白与大麦、玉米、水稻、二穗短柄草、拟南芥的HMT蛋白家族成员进行motif和进化树分析，结果显示，该蛋白与二穗短柄草的BdHMT2位于同一进化枝上(图4)。
[0012]HvHMT3基因的表达模式分析：通过荧光定量PCR技术分析，HvHMT3基因在叶片中的表达量高于茎和根系，干旱胁迫显著诱导了该基因在叶片和根系中的表达(图5A)。采用地高辛(DIG)为标记的原位PCR技术分析，在根系中，HvHMT3基因主要定位在根的中柱和表皮，且在中柱鞘和木质部薄壁细胞中的表达丰度最高；而在叶片中，该基因主要定位在木质部、韧皮部和叶肉细胞(图5B)。HvHMT3的亚细胞定位分析显示，HvHMT3定位于细胞质中(图5C)。
[0013]进一步地，利用农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化技术，获得了HvHMT3基因的过表达和RNAi沉默植株。通过水培PEG模拟干旱试验，对遗传转化植株进行了表型鉴定。结果显示，20％PEG
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6000处理30天后，HvHMT3
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RNAi沉默植株的长势明显弱于野生型(GP)和HvHMT3过表达植株，而在对照条件下，野生型、过表达植株和沉默植株的长势没有显著差异；20％PEG
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6000处理45天后，野生型、过表达植株和沉默植株的生长性状(株高、根长、地上部干重、根系干重)存在显著差异，且HvHMT3过表达植株的存活率显著高于野生型(GP)，而HvHMT3
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RNAi植株的存活率显著低于野本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大麦HvHMT3基因，其特征在于，该基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的大麦HvHMT3基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1所述的大麦HvHMT3基因在调控大麦对干旱胁迫耐受性方面的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，大麦HvHMT3基因过表达使植株耐旱性增强。5.如权利要求4所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：裘程炜，邬飞波，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：