具有改善的酯合酶特性的酶变体制造技术

公开内容涉及用于生产脂肪酸酯的、具有改善的酯合酶特性的酶变体。进一步考虑的是表达此类变体的重组宿主细胞、包含重组宿主细胞的细胞培养物和由此类重组宿主细胞产生的脂肪酸酯组合物。酸酯组合物。酸酯组合物。

【技术实现步骤摘要】
具有改善的酯合酶特性的酶变体
[0001]本申请是申请号为201380058918.5的中国专利技术专利申请的分案申请，母案申请的申请日为2013年3月15日，专利技术名称为“具有改善的酯合酶特性的酶变体”。
[0002]与相关申请的交叉参考
[0003]本申请要求于2012年10月1日提交的美国临时申请号61/708,424和2012年9月14日提交的美国临时申请号61/701,191的利益，所述美国临时申请的整个公开内容通过引用在此并入。
[0004]序列表
[0005]本申请含有序列表，其已经由EFS
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Web以ASCII形式提交且通过引用在此整体并入。ASCII拷贝于2013年3月12日创建，命名为LS00043
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44PCT_SL.txt，并且大小为164,228字节。
专利

[0006]公开内容涉及用于产生脂肪酯的、具有改善的酯合酶特性的酶变体。
[0007]专利技术背景
[0008]石油是以液体、气体或固体形式在地球上发现的有限的天然资源。然而，石油产品是以经济和环境两者上相当大的成本开发。以其天然形式，从地球中提取的原油具有少数商业用途。它是不同长度和复杂性的烃类的混合物，例如石蜡(或烷烃)、链烯(或烯烃)、炔、环烃(或环烷烃)、脂肪族化合物、芳香族化合物等。另外，原油含有其他有机化合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫、盐、酸、金属等)。由于其高能量密度及其容易运输性，将大多数石油精炼成燃料，例如运输燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、取暖用油、液化石油气等。
[0009]石油化学品可以用于制备专用化学品，例如塑料、树脂、纤维、弹性体、药物、润滑剂或凝胶。可以由石油化学品原材料产生的专用化学品的例子包括脂肪酸、烃类(例如长链烃、支链烃、饱和烃、不饱和烃等)、脂肪醇、脂肪酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。专用化学品可以具有许多商业用途。脂肪酸在商业上用作表面活性剂。表面活性剂可见于去污剂和肥皂中。脂肪酸还可以用作燃料、润滑油、涂料、油漆、蜡烛、起酥油、化妆品和乳化剂中的添加剂。另外，脂肪酸用作橡胶产品中的加速活化剂。脂肪酸还可以用作原料以产生甲基酯、酰胺、胺、酰基氯、酸酐、烯酮二聚物、以及过氧酸和酯。
[0010]酯具有许多商业用途。例如，生物柴油，一种代用燃料，其由酯(例如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等)组成。一些低分子量酯是挥发性的，具有令人愉快的气味，这使得其可用作芳香剂或调味剂。另外，酯用作油漆、涂料和清漆的溶剂。此外，一些天然存在的物质例如蜡、脂肪和油由酯组成。酯还用作树脂和塑料中的软化剂、增塑剂、阻燃剂以及汽油和油中的添加剂。另外，酯可以用于制造聚合物、薄膜、纺织品、染料和药物。
[0011]需要用于制备目前衍生自石油的燃料和产品两者的替代途径。像这样，微生物系统提供了用于众多类型的生物燃料和化学品的生物生产的潜力。可再生燃料和化学品可以来自遗传改造的生物体(例如细菌、酵母和藻类)。天然存在的生物合成途径可以遗传改变，
以允许经改造的生物体合成可再生燃料和化学产品。另外，微生物可以进行定制或代谢改造，以利用多种碳源作为生产燃料和化学产品的原料。例如，FAME(脂肪酸甲酯)可以通过将甲醇加入重组宿主细胞培养物中进行生产，所述重组宿主细胞表达蜡酯合酶，例如衍生自除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)(“M.hydrocarbonoclasticus”)的蜡酯合酶。然而，来自除烃海杆菌的野生型蜡酯合酶的表达不产生显著量的FAME，因此高度希望开发改善的蜡酯合酶。另外，来自除烃海杆菌的野生型蜡酯合酶产生显著量的β羟基(“β
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OH”)酯，其通常在衍生自植物来源的燃料或化学品中未发现。参见例如专利合作条约申请号PCT/US12/31682，其通过引用并入本文。因此，希望改造酯合酶以产生更高得率的脂肪酯；和当在重组宿主细胞中表达时，酯合酶产生更高得率的脂肪酸而不产生显著量的β
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OH酯。最后，希望改造具有酯合酶活性的其他酶，以进一步改善脂肪酯生产的得率。
[0012]尽管领域中的进展，仍需要在遗传修饰的酶、重组宿主细胞、方法和系统中的改善，以便通过重组宿主细胞的发酵，实现稳健和成本有效的目的燃料和化学品产生。本公开内容通过提供增加脂肪酯得率的许多酯合酶变体解决该需要。公开内容的酯合酶变体中的一些还改变(即增加或降低)通过重组宿主细胞发酵产生的脂肪酯组合物的β
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OH酯含量，所述重组宿主细胞表达酯合酶变体。本公开内容通过提供许多硫酯酶变体进一步解决该需要，所述硫酯酶变体已改造为具有更大的酯合酶活性，从而进一步增强脂肪酯生产。
[0013]专利技术概述
[0014]本专利技术的一个方面提供了具有SEQ ID NO:2的变体酯合酶多肽，其中所述变体酯合酶多肽遗传改造为具有在如下氨基酸位置处的至少一个突变，所述氨基酸位置包括但不限于氨基酸4、5、7、15、24、30、33、39、40、41、43、44、58、73、76、77、78、80、98、99、101、102、111、122、131、146、147、149、150、155、157、162、164、166、170、171、172、173、177、179、182、184、185、186、187、188、190、192、193、195、197、201、202、203、206、207、212、216、219、234、239、242、243、244、246、255、257、258、259、260、262、263、264、265、266、267、285、288、289、293、294、301、302、303、304、306、307、309、310、311、313、314、315、316、317、319、320、323、328、334、348、349、351、352、353、356、357、360、366、375、381、393、394、395、409、411、413、420、424、442、443、447、454、455、457、458、461、466、468和472，其中与相应的野生型多肽相比较，变体酯合酶多肽具有改善的脂肪酸甲酯活性。在相关方面，变体多肽是除烃海杆菌(WS377)酯合酶多肽。在另一个相关方面，与表达相应的野生型多肽的重组宿主细胞相比较，变体酯合酶多肽在重组宿主细胞中的表达导致更高滴度的脂肪酯组合物。滴度是至少约5百分比或更大。脂肪酯组合物包括但不限于脂肪酸甲酯(FAME)、脂肪酸乙酯(FAEE)、脂肪酸丙酯、脂肪酸异丙酯、脂肪酸丁酯、甘油单酯、脂肪酸异丁酯、脂肪酸2
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丁酯和脂肪酸叔丁酯。变体酯合酶具有改善的酯合酶活性，特别是改善的脂肪酸甲酯活性，其导致改善的特性，包括但不限于增加的β羟基酯、减少的β羟基酯、增加的脂肪酸酯链长和减少的脂肪酸酯链长。
[0015]公开内容的另一个方面提供了具有SEQ ID NO:2的变体酯合酶多肽，其中所述变体酯合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含SEQ ID NO:2的变体酯合酶多肽，其中所述变体酯合酶多肽遗传改造为具有在选自下述氨基酸位的氨基酸位置处的至少一个突变：4、5、7、15、24、30、33、39、40、41、43、44、58、73、76、77、78、80、98、99、101、102、111、122、131、146、147、149、150、155、157、162、164、166、170、171、172、173、177、179、182、184、185、186、187、188、190、192、193、195、197、201、202、203、206、207、212、216、219、234、239、242、243、244、246、255、257、258、259、260、262、263、264、265、266、267、285、288、289、293、294、301、302、303、304、306、307、309、310、311、313、314、315、316、317、319、320、323、328、334、348、349、351、352、353、356、357、360、366、375、381、393、394、395、409、411、413、420、424、442、443、447、454、455、457、458、461、466、468和472，其中与相应的野生型多肽相比较，所述变体酯合酶多肽具有改善的脂肪酸甲酯活性。2.权利要求1的变体酯合酶多肽，其中所述多肽是除烃海杆菌(WS377)酯合酶多肽。3.权利要求1的变体酯合酶多肽，其中与表达所述相应的野生型多肽的重组宿主细胞相比较，所述变体酯合酶多肽在重组宿主细胞中的表达导致更高滴度的脂肪酯组合物。4.权利要求3的变体酯合酶，其中所述滴度是至少约5％或更大。5.权利要求3的变体酯合酶，其中所述脂肪酯组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：