氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种氨基葡萄糖

【技术实现步骤摘要】
氨基葡萄糖
‑
6磷酸合成酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，尤其涉及一种氨基葡萄糖
‑
6磷酸合成酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。
[0003]现如今微生物发酵法是国内外生产GlcNAc的主要方法。所使用的基因工程菌主要为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)。通过在这些菌株中引入氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸合成酶(glmS)和氨基葡萄糖6
‑
磷酸N
‑
乙酰转移酶(gna1)编码基因，以葡萄糖为原料，进行乙酰氨基葡萄糖的微生物合成。
[0004]对乙酰氨糖的生物合成研究表明在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6
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磷酸果糖在氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸合成酶(glmS)的催化作用下，生成六磷酸氨糖，该步是乙酰氨糖合成途径中的第一个限速反应。而氨基葡萄糖
‑
6磷酸合成酶是一种双底物结合酶，属于氨基转移酶类，催化活力较低，且会受到负反馈抑制，限制了乙酰氨糖产量和原料的转化率。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术通过对6
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磷酸果糖在氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸合成酶(glmS)进行定点突变，得到其突变体，从而提高了此酶的催化活力，提高了大肠杆菌生产乙酰氨基葡萄糖的能力。具有重要的经济价值和社会意义。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种氨基葡萄糖
‑
6磷酸合成酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生glmS的第39位和149位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第250位的精氨酸突变为半胱酰胺以及第472位的甘氨酸突变为丝氨酸。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供编码所述氨基葡萄糖
‑
6磷酸合成酶突变体的基因。
[0008]进一步地，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述的基因的表达载体。
[0010]本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述的氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体的细胞。
[0011]本专利技术的第五个目的是提供一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，所述的方法是以氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体为催化剂，催化葡萄糖生产乙酰氨基葡萄糖。
[0012]进一步地，所述的方法具体是以大肠杆菌为宿主，重组表达编码所述的氨基葡萄
糖
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6磷酸合成酶突变体的基因，得到重组菌；将重组大肠杆菌经种子培养基活化后转入发酵培养基，于35～38℃、pH＝6～8条件下培养，OD600达到18～22时加入IPTG诱导氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体的表达，使重组菌以葡萄糖为底物生产乙酰氨基葡萄糖。
[0013]进一步地，种子培养基按g/L计含有：胰蛋白脉5～15，酵母粉3～7，NaCl 8～12。
[0014]进一步地，发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨10～15，酵母粉20～30，磷酸氢二钾12～13，磷酸二氢钾2～3，甘油2～6，葡萄糖流加。
[0015]进一步地，所述的IPTG的浓度为0.2～0.6mM。
[0016]借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：
[0017]本专利技术通过定点突变glmS基因，提高了N
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乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量，其浓度最高可达140g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本专利技术提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
[0018]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细说明如后。
具体实施方式
[0019]涉及的检测方法：
[0020]N
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乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
[0021]高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260,RID检测器，HPX
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87H柱(Bio
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Rad Hercules,CA)，流动相:5mM H2S04，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。
[0022]glmS是基因工程大肠杆菌合成氨糖的代谢途径中第一个限速反应，为了解决目前glmS催化活力弱和受负反馈抑制，限制大肠杆菌乙酰氨糖产量的问题，本专利技术提供一种氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生glmS的第39位和149位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第250位的精氨酸突变为半胱酰胺以及第472位的甘氨酸突变为丝氨酸。编码所述野生型glmS的碱基序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。来源于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。突变后碱基序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
[0023]实施例1：
[0024]定点突变
[0025]利用快速PCR技术，以表达有野生型glmS的基因的质粒pET28a
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glmS
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gna1(pET28a
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glmS
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gna1的构建方法参见:陈欣.代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制[D].无锡：江南大学,2012)为模板，进行定点突变。使用第39位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
[0026]正向引物(SEQ ID NO.5)：5
’‑
atgaccttctgtatcaacaacggc
‑3’
[0027]反向引物(SEQ ID NO.6)：5
’‑
gccgttgttgatacagaaggtcat
‑3’
[0028]PCR反应体系均为：PrimeSTAR Max(购自Takara公司)25μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，加入双蒸水22μL。
[0029]PCR反应扩增条件为：98℃预变性5min；随后98℃10s，55℃15s，72℃3min进行30本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生glmS的第39位和149位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第250位的精氨酸突变为半胱酰胺以及第472位的甘氨酸突变为丝氨酸。2.一种编码权利要求1所述的氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种携带权利要求2所述的基因的表达载体。5.一种表达权利要求1所述的氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体的细胞。6.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求1所述的氨基葡萄糖
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6磷酸合成酶突变体为催化剂，催化葡萄糖生产乙酰氨基葡萄糖。7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，卢健行，吕雪芹，堵国成，李江华，卢建功，刘长峰，
申请(专利权)人：山东润德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：