【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵，具体涉及一种微生物发酵法生产透明质酸的方法。
技术介绍
1、透明质酸（hyaluronic acid，简称ha）又被叫做玻尿酸、玻璃酸等，是一种常见的大分子粘多糖。天然透明质酸都来自于动物和微生物，动物体的各个部位都含有不同量的透明质酸，其中含量较多的有结缔组织、关节液、玻璃体、脐带和皮肤等。微生物主要存在于菌体的外荚膜中。透明质酸具有保湿、抗炎、促进细胞再生等强大的生理功能，已被开发并广泛应用于食品、医疗、美容等领域中。工业上透明质酸的生产方法以微生物发酵法和动物组织提取法最为常见。由于动物组织提取法存在提取率低、质量差、污染性高等缺点，导致该方法在目前市场中占有率很小，并有逐渐被微生物发酵法完全替代的趋势。目前工业上透明质酸生产的主要菌株是马链球菌兽疫亚种（兽疫链球菌（s. zooepidemicus））。兽疫链球菌荚膜层天然包含透明质酸，利用兽疫链球菌发酵生产透明质酸具有发酵周期短，生产强度大，产物提纯简便等优点。同时，兽疫链球菌发酵生产获得的透明质酸分子量高，可以在体外降解为低分子量透明质酸及透明质酸寡糖等，更具应用价值。因此，提高兽疫链球菌的透明质酸生产水平具有重要意义。
2、但是，利用兽疫链球菌发酵制备透明质酸存在诸多问题。文献《透明质酸的生物合成及其代谢工程的研究进展》中提到，在透明质酸生物合成过程中，存在前体底物和ha产物之间不平衡的问题，ha合成的两个合成前体d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖同时也是用于菌体细胞壁生物合成的前体，因此菌体自身的细胞生长和ha合成存在底物的竞
3、专利cn107653280a公开了一种透明质酸发酵用的组合物、培养基和方法及其应用，所述组合物包括n-乙酰葡糖胺和天冬氨酸，还含有尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种，通过向培养基中补充ha合成的前体物质，可以有效的缓解ha合成过程中，由于竞争性前体物质缺乏导致的ha合成乏力的问题，而且研究结果表明，通过添加以上前体物质，ha产率可提高10％-40％，解决了在发酵过程中，透明质酸产率低的问题。尽管其相较于空白对照组中透明质酸的产量显著提高，但是通过分析其不同处理的配方以及透明质酸的产量可以看出，对比例4虽然省略了添加天冬氨酸，但是其透明质酸的产量在14h后反而高于实施例2和实施例5中透明质酸产量；另外由于其在初始培养基中补充ha合成的前体物质，因此ha在发酵前期产量快速提高，但是在发酵到14h以后，ha的产量出现了下降趋势，这可能是由于发酵前期由于发酵培养基中ha合成前体充足，但是在发酵后期由于菌体自身的细胞生长和ha合成存在底物的竞争，透明质酸的合成前体依旧不足导致，从而限制了透明质酸产量的提高。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种微生物发酵法生产透明质酸的方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面，提供一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，包括以下步骤：
4、将马链球菌兽疫亚种种子液接种于含有黄芪提取物和丝氨酸的发酵培养基中，发酵培养，得到含有透明质酸的发酵液；
5、发酵培养过程中，通过分批补料的方式向发酵培养基中加入n-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸。
6、作为优选，马链球菌兽疫亚种种子液的接种量为发酵培养基体积的7%-15%；马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数≥1×109cfu/ml。
7、作为优选，发酵培养的条件为：
8、搅拌转速为300-500rpm，通气速度为1.0-2.0vvm，培养温度为35-40℃，培养时间为16-18h，通过加入5 mol/l naoh调整发酵培养基的ph为7.0-7.5。
9、作为优选，在发酵至6、10、14h时，分别向发酵培养基中加入初始发酵培养基质量分数0.5-1%的n-乙酰氨基葡萄糖和0.5-1%的尿苷二磷酸。
10、作为优选，发酵培养基中，黄芪提取物的含量为10-30g/l，丝氨酸的含量为2-3g/l。
11、作为优选，所述发酵瓶培养基的组成为：
12、葡萄糖80-100 g/l，蛋白胨10-15g/l，酵母浸粉10-15g/l，mgso4·7h2o 1.5-2.5g/l，k2hpo4·3h2o 1.5-2 g/l，黄芪提取物 10-30g/l，丝氨酸 2-3g/l。
13、作为优选，所述黄芪提取物由如下方法制备而成：
14、将黄芪根干燥、粉碎后过筛，得到黄芪粉末，向黄芪粉末中加水混匀，采用高压协同微波法提取，过滤，得到水提液；将水提液浓缩、干燥得到黄芪提取物。
15、作为优选，黄芪粉末和水的料液比为1g：（15-25）ml。
16、作为优选，高压协同微波提取的条件为：压力为10-30mpa，温度为 60-70℃，微波提取的功率为 400-500w，提取时间为10-30min。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术通过向培养基中加入黄芪提取物和丝氨酸，并在发酵培养过程中向发酵培养基中补充ha合成的前体物质n-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，黄芪提取物的加入提高了马链球菌兽疫亚种的菌活性，提高了发酵过程中的菌体浓度；丝氨酸的加入不仅有利于菌体的生长，还有利于碳酸流向ha合成的支路，减少了乳酸的合成，从而促进透明质酸的合成；n-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸的加入缓解了菌体自身细胞生长和ha合成的底物竞争，并促进了发酵后期ha的合成，进一步提高了透明质酸的产量。
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1.一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，马链球菌兽疫亚种种子液的接种量为发酵培养基体积的7%-15%；马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数≥1×109cfu/ml。
3.根据权利要求2所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，发酵培养的条件为：
4.根据权利要求3所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，在发酵至6、10、14h时，分别向发酵培养基中加入初始发酵培养基质量分数0.5-1%的N-乙酰氨基葡萄糖和0.5-1%的尿苷二磷酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，发酵培养基中，黄芪提取物的含量为10-30g/L，丝氨酸的含量为2-3g/L。
6.根据权利要求5所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，所述发酵瓶培养基的组成为：
7.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，所述黄芪提取物由如下方法制备而
8.根据权利要求7所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，黄芪粉末和水的料液比为1g：（15-25）ml。
9.根据权利要求7所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，高压协同微波提取的条件为：压力为10-30Mpa，温度为 60-70℃，微波提取的功率为 400-500W，提取时间为10-30min。
...【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，马链球菌兽疫亚种种子液的接种量为发酵培养基体积的7%-15%；马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数≥1×109cfu/ml。
3.根据权利要求2所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，发酵培养的条件为：
4.根据权利要求3所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，在发酵至6、10、14h时，分别向发酵培养基中加入初始发酵培养基质量分数0.5-1%的n-乙酰氨基葡萄糖和0.5-1%的尿苷二磷酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢健行，张倩，张敏，徐艳，袁涛，林为惺，
申请(专利权)人：山东润德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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