一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法，该方法将生化反应与可视化微球计数、机器视觉与深度学习相结合，以高分子微球作为信号探针，将与待测目标物对应的生物识别分子分别偶联在纳米磁颗粒和信号探针表面，进行免疫反应或者DNA分子杂交反应，磁分离后直接对反应复合物中的信号探针进行光学显微成像计数，并使用不同粒径或颜色的信号探针用于区分不同的检测对象，最终实现了多种目标物的同时检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法
本专利技术属于生化分析领域，涉及一种同时检测多种目标物的生化分析方法。
技术介绍
随着国家发展与人民生活水平提高，食品安全、体外诊断和环境监测等领域所面临的挑战与日俱增，高效的检测手段在保障食品安全、生态环境安全，促进人类健康等方面都具有极其重要的影响。传统检测方法大多都依赖于大型精密仪器设备，虽然具有精度高、准确性好等特点，但是大部分仪器造价昂贵且携带不便，使用前需要对检测样品进行复杂的前处理，对使用仪器设备的人员也有较为严格的要求。基于抗体-抗原识别反应的免疫分析方法在食品安全和体外诊断领域应用广泛。传统的酶联免疫吸附法(ELISA)具有灵敏度高、成本低等优点，但整个实验操作繁琐且耗时长，不能实现对同一样品中的多个目标物同时检测；胶体金试纸条法操作简便且检测速度快，但灵敏度比较低，仅适用于定性分析或半定量分析；荧光免疫检测法检测精度高速度快，对多目标物检测具有良好的适应性，但检测所需仪器设备造价昂贵，且荧光试剂需要避光稳定性较差。采用高分子微球作为信号探针，将颗粒计数和免疫分析相结合，能够实现高灵敏度下的准确检测。目前颗粒计数已有多种实现方式，例如申请人前期研究中报道的库尔特小孔颗粒电阻法和差分阻抗法等，但是小孔颗粒电阻计数器造价昂贵，而且小孔管易发生堵塞，相比之下，光学显微成像法能够直接读取微球数量，因此检测成本更低，操作也更加便捷。例如CN109521202A公开了一种基于数字免疫分析的蛋白质定量方法，该方法将捕获磁珠、目标抗原和检测颗粒进行免疫反应，形成免疫复合物，然后将免疫复合物中的检测颗粒洗脱并转移至微流控颗粒计数芯片，检测颗粒沉积固定在芯片上，对所有固定在芯片上的检测颗粒进行成像记录，统计芯片上检测颗粒的数量，即得到目标蛋白的分子数。该方法实现了疾病相关蛋白质的超灵敏、绝对定量分析，但是无法实现对多种目标物的同时检测，且该方法操作比较复杂，需要通过多步步骤将检测颗粒从免疫复合物上洗脱下来，容易造成累计误差，影响了检测结果的稳定性和准确性。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提出了一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法，该方法将生化反应与可视化微球计数、机器视觉与深度学习相结合，将与待测目标物对应的生物识别分子分别偶联在纳米磁颗粒和信号探针表面，进行免疫反应或者DNA分子杂交反应，磁分离后直接对反应复合物中的信号探针进行光学显微成像计数，本专利技术通过使用不同粒径或颜色的信号探针用于区分不同的检测对象，最终实现了多种目标物的同时检测。本专利技术所使用的技术手段如下：一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法，包括以下步骤：1)以不同粒径和/或不同颜色的高分子微球为信号探针，将多种目标物的生物识别分子分别与不同粒径和/或不同颜色的高分子微球偶联，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时将多种目标物对应的生物识别分子与纳米磁颗粒偶联，将高分子微球偶联物和纳米磁颗粒偶联物同时加入到待测样品进行生化反应，接着进行磁分离，收集含有反应复合物的分离液备用；2)将含有反应复合物的分离液滴加到划分网格的载玻片上，涂匀后盖上玻片，光学显微镜对焦后对不同网格的计数区域进行分别拍照，并将高清图像传送至计算机；3)计算机对高清图像中的微球粒径和/或颜色进行区分，并在Python机器视觉识别和深度学习的基础上得出反应复合物中每一种粒径和/或每一种颜色的高分子微球数量，最后根据每一种高分子微球的数量计算待测样品中不同种类目标物的含量，实现多种目标物的定量检测。优选地，所述高分子微球的粒径为1～50μm，所述纳米磁颗粒的粒径为100～500nm。优选地，所述不同粒径的高分子微球，它们的粒径倍数应≥2。优选地，所述不同颜色的高分子微球，它们的颜色分别为紫色、红色、橙色、黑色、蓝色、绿色、黄色或白色中的任一种。优选地，所述高分子微球为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丁二烯微球、聚异戊二烯微球中的任一种。优选地，所述光学显微镜的种类为正置光学显微镜、倒置光学显微镜、荧光显微镜或金相显微镜，显微镜放大倍数为50～5000倍。所述生化反应包括免疫竞争反应、免疫夹心反应或DNA分子杂交反应。所述目标物包括病毒、生物标志物、抗生素分子、农药分子、兽药分子、生物毒素、细菌。本专利技术中的生物识别分子及其对应的生物识别分子包括完全抗原/抗体、捕获抗体/检测抗体、DNA捕获探针/DNA检测探针等，以完全抗原/抗体为例，本专利技术的检测原理如下：参见图1，将识别不同检测对象的抗体分别偶联在纳米磁颗粒表面，将不同检测对象的完全抗原分别偶联在不同粒径和/或不同颜色的高分子微球(如聚苯乙烯微球)表面，将上述偶联物同时加入到待测样品并进行免疫反应，高分子微球上结合的完全抗原和待测样品中的目标物竞争性地与纳米磁颗粒上的抗体相结合，生成纳米磁颗粒-抗体-待测物-完全抗原-高分子微球复合物，当待测样品中的目标物含量越高则生成的复合物越少，反之，当待测样品中的目标物含量越少则生成的复合物越多，复合物的数量与目标物的含量负相关。接着将复合物从反应体系中进行磁分离，除去未参与反应的高分子微球和样品基质，然后对含有复合物的分离液进行收集，复合物中的高分子微球数量反映的是待测样品中目标物的含量，二者呈负相关。由于一种粒径和/或颜色的高分子微球对应的是一种目标物，因此通过检测不同粒径和/或不同颜色的高分子微球数量得到不同目标物的含量。本专利技术提出了一种机器视觉可视化的计数方法，该方法通过高倍光学显微镜拍照，并在Python机器视觉识别微球的同时进行深度学习提高微球识别准确度。首先，基于光学成像原理对复合物中的高分子微球进行成像，取一定量分离液滴于划分网格的载玻片上涂匀，盖上载玻片后放置于高倍光学显微镜下完成自动对焦，载玻片放置于自动化导轨平台上可对载玻片实现XOY坐标系的定点平移，从而对不同的计数区域分别拍照，复合物中存在不同颜色和/或不同粒径的高分子微球。接着，高倍显微镜将所拍取的微球图像传送至计算机，通过机器视觉微球识别对高分子微球的颜色、粒径进行识别记录并同时结合深度学习，快速高效准确地识别微球数量。同时，由于纳米磁颗粒的粒径远小于高分子微球的粒径且超出光学显微镜的成像极限，因此复合物及分离液中的纳米磁颗粒不会被机器视觉识别。参见图2所示，为不同粒径的高分子微球信号探针在光学显微镜成像图片。为实现多目标物检测，选用不同粒径的高分子微球信号探针偶联不同种类的生物识别分子，每种粒径的高分子微球信号探针即代表一种待测目标物，每种粒径的高分子微球信号探针的数量与待测目标物含量相关。图中所示为1μm和3μm的高分子微球信号探针在光学显微镜下放大1000倍的成像图片，待计算机机器视觉识别后完成不同粒径高分子微球信号探针识别计数，即可推算不同种类的待测目标物含量，实现多目标物检测。参见图3所示，为不同颜色的高分子微球信号探针在光学显微镜成像图片，为实现多目标物检测，选用不同颜色的高分子微球信号探针偶联不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)以不同粒径和/或不同颜色的高分子微球为信号探针，将多种目标物的生物识别分子分别与不同粒径和/或不同颜色的高分子微球偶联，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时将多种目标物对应的生物识别分子与纳米磁颗粒偶联，将高分子微球偶联物和纳米磁颗粒偶联物同时加入到待测样品进行生化反应，接着进行磁分离，收集含有反应复合物的分离液备用；/n2)将含有反应复合物的分离液滴加到划分网格的载玻片上，涂匀后盖上玻片，光学显微镜对焦后对不同网格的计数区域进行分别拍照，并将高清图像传送至计算机；/n3)计算机对高清图像中的微球粒径和/或颜色进行区分，并在Python机器视觉识别和深度学习的基础上得出反应复合物中每一种粒径和/或每一种颜色的高分子微球数量，最后根据每一种高分子微球的数量计算待测样品中不同种类目标物的含量，实现多种目标物的定量检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以不同粒径和/或不同颜色的高分子微球为信号探针，将多种目标物的生物识别分子分别与不同粒径和/或不同颜色的高分子微球偶联，每一种粒径和/或颜色对应一种目标物，同时将多种目标物对应的生物识别分子与纳米磁颗粒偶联，将高分子微球偶联物和纳米磁颗粒偶联物同时加入到待测样品进行生化反应，接着进行磁分离，收集含有反应复合物的分离液备用；
2)将含有反应复合物的分离液滴加到划分网格的载玻片上，涂匀后盖上玻片，光学显微镜对焦后对不同网格的计数区域进行分别拍照，并将高清图像传送至计算机；
3)计算机对高清图像中的微球粒径和/或颜色进行区分，并在Python机器视觉识别和深度学习的基础上得出反应复合物中每一种粒径和/或每一种颜色的高分子微球数量，最后根据每一种高分子微球的数量计算待测样品中不同种类目标物的含量，实现多种目标物的定量检测。


2.如权利要求1所述基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法，其特征在于：所述高分子微球的粒径为1～50μm，所述纳米磁颗粒的粒径为100～500nm。


3.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翊平，周阳，王知龙，赵维琦，鲁鹏，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42