一种胶乳增强竞争免疫比浊检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于改善胶乳增强竞争免疫比浊分析灵敏度的方法以及基于该方法的检测试剂盒。本发明专利技术利用生物素对抗体的多重标记和生物素‑亲合素之间的结合反应，可以使用微量的BLAAA建立胶乳增强竞争免疫比浊分析方法，显著改善检测敏感性。

【技术实现步骤摘要】
一种胶乳增强竞争免疫比浊检测方法及试剂盒
本专利技术属于生化检测领域，具体涉及一种胶乳增强竞争免疫比浊检测方法及试剂盒。
技术介绍
胶乳增强免疫比浊检测(Latexenhancedturbidimetricimmunoassay，LETIA)是一种经典的免疫检测方法，它将抗体或抗原偶联于纳米尺寸的胶乳微球表面，利用抗体-抗原间高度特异性的结合，使胶乳微球表面的抗体或抗原与标本所含的待测物反应而形成微球聚集体，进而使免疫反应体系在特定波长下的吸光度发生变化，通过测定该变化计算标本中待测物的浓度。迄今，LETIA在临床医学中已得到广泛应用，涉及肿瘤、风湿、肝功能、肾功能和药物浓度监测等诸多领域。然而，尽管LETIA已广泛应用于常规临床分析，但由于该方法较低的分析灵敏度，以LETIA准确定量标本中含量极低的待测物浓度，仍然是一个挑战。胶乳增强竞争免疫比浊检测是LETIA的一种实施方式，其通过标本所含待测物与检测体系固定量的待测物竞争结合限量的抗待测物抗体实现对待测物的定量，常用于小分子待测物的检测，如：地高辛、他克莫司(Tacrolimus)、环孢素、甲胺喋呤、伊马替尼、黄曲霉素、克伦特罗和苏丹红，等。被本领域技术人员所熟知的用于小分子待测物检测的增强竞争免疫比浊检测通常采用待测物小分子偶联微球直接法和抗体偶联微球直接法两种模式，其原理分别示于图1-B及图1-C。在待测物小分子偶联微球直接法模式中(图1-B)，标本所含待测物小分子与偶联于微球表面的待测物小分子竞争结合限量的抗待测物抗体，当标本中不含待测物时，抗体可通过其二个结合位点桥联二个不同的微球，从而引发凝集；当标本中含有待测物时，抗体结合位点被待测物占据，胶乳微球的凝集受到抑制。该模式下，抗体的两个结合位点均与同一胶乳微球表面的二个待测物分子结合的那部分抗体，将失去桥联两个胶乳微球的能力，从而无法引发凝集。尽管经过充分的工艺优化，本专利技术人采用此模式建立的他克莫司LETIA，其可获得的他克莫司最高灵敏度仅约6.9ng/mL。抗体偶联微球直接法(图1-C)需要先将小分子与蛋白质或其它载体偶联，制备载体-小分子复合物，使单一载体分子上含有多个小分子；由于载体-小分子复合物和抗体-胶乳微球的多价性，在适当的条件下载体-小分子复合物与抗体-胶乳微球很容易引发凝集，而标本中的小分子待测物通过占据胶乳微球表面的抗体结合位点而抑制这种凝集反应，根据凝集反应的被抑制程度，可定量标本中的小分子待测物浓度。本专利技术人采用此模式研制了人全血他克莫司胶乳增强竞争免疫比浊检测试剂(CFDA注册证号:20192400305)，尽管其具有优良的检测准确性，可获得的他克莫司LOD(检测下限，LimitofDetection)仅约1.0ng/mL。1.0ng/mL的LOD对于大多数他克莫司临床监测已足够灵敏，但对于联合免疫抑制用药的器官移植患者(Acomparative,randomizedtrialofconcentration-controlledsirolimuscombinedwithreduced-dosetacrolimusorstandard-dosetacrolimusinrenalallograftrecipients.TransplantationProceedings,2013，45,2133-2140)和某些使用低剂量他克莫司治疗的自身免疫性疾病患者(Changesinthebloodlevel,efficacy,andsafetyoftacrolimusinpregnancyandthelactationperiodinpatientswithsystemiclupuserythematosus.Lupus.2018，27:2245-2252)，进一步改善其检测灵敏度将有助于更准确地检测这些患者血液中的低浓度药物。因此，寻找可以有效改善胶乳增强竞争免疫比浊检测灵敏度的方法，将有助于更准确地检测标本中低含量的小分子待测物的浓度，拓展胶乳增强竞争免疫比浊检测的待测物范围。
技术实现思路
为解决现有胶乳增强竞争免疫比浊检测灵敏度低、难以准确检测低浓度小分子待测物的技术问题，本专利技术提供一种新的胶乳增强竞争免疫比浊检测模式(如图1-A所示)以及基于该检测方法的试剂盒。该模式下，由于生物素对抗待测物抗体的多重标记，生物素标记的抗待测物抗体(Biotinlabeledanti-analyteantibodies，BLAAA)与胶乳微球表面的待测物结合可在所述胶乳微球表面引入大量的生物素，即使使用少量的BLAAA，也可在四价亲合素的存在下引发有效的凝集反应，因此，本模式可以使用微量的BLAAA建立胶乳增强竞争免疫比浊检测方法，显著改善检测灵敏度。本专利技术提供了一种胶乳增强竞争免疫比浊检测方法，其包含如下步骤：(1)将生物素标记的抗待测物抗体(Biotinlabeledanti-analyteantibodies，BLAAA)与校准品或标本混匀，孵育，得混合液1；(2)将步骤(1)中所述混合液1与亲合素和待测物偶联的胶乳微球混匀，并检测初始吸光度A1，孵育后检测吸光度A2，计算吸光度增值ΔA，ΔA＝A2-A1；(3)以校准品的吸光度增值ΔA对其所含待测物浓度建立校准曲线，通过比对标本的吸光度增值ΔA实现对所述标本中待测物浓度的定量检测。或，(1)将生物素标记的抗待测物抗体(BLAAA)与校准品或标本混匀，孵育，得混合液1；(2)将步骤(1)中所述混合液1与待测物偶联的胶乳微球混匀，孵育，得混合液2；(3)将步骤(2)中所述混合液2与亲合素混匀，并检测初始吸光度A1，孵育后检测吸光度A2，计算吸光度增值ΔA，ΔA＝A2-A1；(4)以校准品的吸光度增值ΔA对其所含待测物浓度建立校准曲线，通过比对标本的吸光度增值ΔA实现对所述标本中待测物浓度的定量检测。本专利技术中，所述抗待测物抗体指能与待测物发生特异性免疫结合反应、具有抗体结构特征的蛋白质。本专利技术中，所述待测物指胶乳增强竞争免疫比浊检测可检测的人体、动物体、植物体以及自然界非生物体所含的各种小分子物质，如：地高辛、他克莫司(Tacrolimus)、环孢素、氯氮平、阿立哌唑、奥氮平、地西泮、喹硫平、利培酮、阿米替林、度洛西汀、去甲替林、文拉法辛、西酞普兰、丙咪嗪、舍曲林、卡马西平、奥卡西平、丙戊酸、苯妥英、拉莫三嗪、左乙拉西坦、托吡酯、黄曲霉素、两性霉素B、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、替考拉宁、万古霉素、利奈唑胺、阿米卡星、多粘菌素B、替加环素、氯霉素、三聚氰胺、伏马毒素、黄曲霉素M1、黄曲霉素B1、克伦特罗或沙丁胺醇。本专利技术中，所述生物素标记的抗待测物抗体可采用生物素标记试剂，按本领域常用的生物素标记方法制得。所述的生物素标记试剂包括但不限于与蛋白质氨基反应的各种臂长的生物素琥珀酰亚胺酯，与蛋白质巯基反应的各种臂长的生物素马来酰亚胺衍生物，与蛋白质羧基反应的各种臂长的生物素氨基化衍生物。本领域技术人员可采用商品试剂盒(如：Bioti本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶乳增强竞争免疫比浊检测方法，其包含如下步骤：/n(1)将生物素标记的抗待测物抗体(Biotin labeled anti-analyte antibodies，BLAAA)与校准品或标本混匀，孵育，得混合液1；/n(2)将步骤(1)中所述混合液1与亲合素和待测物偶联的胶乳微球混匀，并检测初始吸光度A1，孵育后检测吸光度A2，计算吸光度增值ΔA，ΔA＝A2-A1；/n(3)以校准品的吸光度增值ΔA对其所含待测物浓度建立校准曲线，通过比对标本的吸光度增值ΔA实现对所述标本中待测物浓度的定量检测。/n或，/n(1)将生物素标记的抗待测物抗体(BLAAA)与校准品或标本混匀，孵育，得混合液1；/n(2)将步骤(1)中所述混合液1与待测物偶联的胶乳微球混匀，孵育，得混合液2；/n(3)将步骤(2)中所述混合液2与亲合素混匀，并检测初始吸光度A1，孵育后检测吸光度A2，计算吸光度增值ΔA，ΔA＝A2-A1；/n(4)以校准品的吸光度增值ΔA对其所含待测物浓度建立校准曲线，通过比对标本的吸光度增值ΔA实现对所述标本中待测物浓度的定量检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种胶乳增强竞争免疫比浊检测方法，其包含如下步骤：
(1)将生物素标记的抗待测物抗体(Biotinlabeledanti-analyteantibodies，BLAAA)与校准品或标本混匀，孵育，得混合液1；
(2)将步骤(1)中所述混合液1与亲合素和待测物偶联的胶乳微球混匀，并检测初始吸光度A1，孵育后检测吸光度A2，计算吸光度增值ΔA，ΔA＝A2-A1；
(3)以校准品的吸光度增值ΔA对其所含待测物浓度建立校准曲线，通过比对标本的吸光度增值ΔA实现对所述标本中待测物浓度的定量检测。
或，
(1)将生物素标记的抗待测物抗体(BLAAA)与校准品或标本混匀，孵育，得混合液1；
(2)将步骤(1)中所述混合液1与待测物偶联的胶乳微球混匀，孵育，得混合液2；
(3)将步骤(2)中所述混合液2与亲合素混匀，并检测初始吸光度A1，孵育后检测吸光度A2，计算吸光度增值ΔA，ΔA＝A2-A1；
(4)以校准品的吸光度增值ΔA对其所含待测物浓度建立校准曲线，通过比对标本的吸光度增值ΔA实现对所述标本中待测物浓度的定量检测。


2.如权利要求1所述的胶乳增强竞争免疫比浊检测方法，其特征在于，所述亲合素为含有四个生物素结合位点、能与生物素高亲合性结合的一组蛋白，为亲合素、亲合素聚合物、中和亲合素、中和亲合素聚合物、链霉亲合素或链霉亲合素聚合物。


3.如权利要求1所述的胶乳增强竞争免疫比浊检测方法，其特征在于，所述待测物为小分子待测物，所述小分子待测物为地高辛、他克莫司、环孢素、氯氮平、阿立哌唑、奥氮平、地西泮、喹硫平、利培酮、阿米替林、度洛西汀、去甲替林、文拉法辛、西酞普兰、丙咪嗪、舍曲林、卡马西平、奥卡西平、丙戊酸、苯妥英、拉莫三嗪、左乙拉西坦、托吡酯、黄曲霉素、两性霉素B、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、替考拉宁、万古霉素、利奈唑胺、阿米卡星、多粘菌素B、替加环素、氯霉素、三聚氰胺、伏马毒素、黄曲霉素M1、黄曲霉素B1、克伦特罗或沙丁胺醇。


4.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴冯波，林巍靖，刘斌虎，
申请(专利权)人：上海云泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31