【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体地涉及一种特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对及其应用。
技术介绍
1、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanniie)非发酵需氧革兰阴性球杆菌，属于莫拉菌科，可以引起院内感染的机会致病菌，主要可引起菌血症，泌尿道感染，继发性脑膜炎或是由于诸如使用导尿管和呼吸机而引起的其他感染。过去被认为是一种低风险的病原菌，直到2010年在日本东京帝京大学医学部附属医院的第一次大规模暴发才引起日本当局以及全世界的重视。之后的很多研究都表明鲍曼不动杆菌是造成医院感染的重要条件致病菌，也是造成肺炎和败血症的常见病原体。此外，多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌检出比例日益增高，以致于临床上可供选择的抗生素越来越少，很多患者甚至已无药可用。鲍曼不动杆菌感染常见于危重患者，常伴有其他细菌和(或)真菌的感染。鲍曼不动杆菌感染患者病死率高。目前已发展至多重耐药鲍曼不动杆菌(mdrab)、广泛耐药鲍曼不动杆菌(xdrab)、全耐药鲍曼不动杆菌(pdrab)。2010年中国chinet监测数据显示不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为30.7％、米诺环素为31.2％。目前，临床上耐药细菌的检测主要通过纸片扩散法、试纸条和自动化微生物系统方法检测药敏试验的结果，或者采用pcr的方法检测耐药基因。常规药敏试验通常需要24h才能报告结果，而pcr的方法虽然用时短但较为繁琐，对实验室要求太高，不适合在临床推广。
2、胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,p
3、rpa等温扩增技术，也称重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，rpa)是2006年piepenburg等人利用参与细胞dna合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。rpa的反应过程首先是重组酶与引物结合，形成蛋白-dna复合物，然后蛋白-dna复合物在双链dna寻找同源序列。一旦引物寻找到目标同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，针对模板上的靶序列在数分钟之内完成指数级别的扩增。而被替换的dna链与ssb(单链dna结合蛋白)结合，保持dna维持单链状态，防止被核酸酶水解这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，只需少量的样本制备，即可在10min内扩增低至1-10个dna拷贝，具有高灵敏度、可选择性、便携性、快速与可以进行多重扩增等优点。
技术实现思路
1、本专利技术在胶乳增强技术的原理上进行创新，利用全自动生化平台上结合核酸等温扩增技术进行了一种全新的尝试。将市面上几乎所有全自动生化仪都自带的恒温孵育模块对核酸样本进行恒温扩增，将扩增后产物(每个扩增产物两端各连接一个生物素)通过与偶联有链霉亲和素的胶乳微球特异性结合形成多个胶乳-扩增产物聚集体，从而形成浊度被生化仪检测到；该技术不但可以快速解决普通核酸检测样本的时间限制，还具备胶乳增强比浊技术的高灵敏特性，从而具备了高灵敏检测核酸分子的能力。
2、为解决现有技术中缺乏检测鲍曼不动杆菌的问题，本专利技术提供了一种特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对及其应用。
3、本专利技术通过以下技术方案实现上述问题：
4、本专利技术的第一方面提供一种用于特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如seq id no:1所示，所述反向引物的核酸序列如seq id no:2所示。
5、本专利技术的第二方面提供一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，所述试剂盒除包括如本专利技术第一方面所述的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述鲍曼不动杆菌。
6、在本专利技术一些具体实施方案中，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测。
7、在本专利技术一些较佳实施方案中，所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素。
8、在本专利技术一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种。
9、在本专利技术另一些具体实施方案中，所述试剂盒包括以下一种或多种：
10、(1)所述扩增酶为rpa酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶；优选还包括重组酶辅助因子和肌酸激酶；
11、(2)所述促凝剂选自聚乙二醇peg、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
12、(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和proclin300中的一种或多种；
13、(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和bsa中的一种或多种；
14、(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％ nacl、kcl和mgcl2中的一种或多种，优选0.9％nacl；
15、(6)所述微球储存液选自50～500mm tris、hepes和pbs缓冲液，ph6.5～7.8；优选100mm pbs，ph7.4；
16、(7)所述缓冲液为10～500mm tris或pbs，ph6.5～8.8；优选10mm tris，ph8.0。
17、在本专利技术一些具体实施方案中，所述至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm。
18、优选地，所述试剂盒还包括粒径为147±5nm的聚苯乙烯羧基微球；
19、更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为88nm、147nm和309nm。
20、本专利技术的第三方面提供一种对样品中是否包含鲍曼不动杆菌进行定性的方法，使用如本专利技术第二方面所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
21、(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增，
22、(2)加入最大粒径聚苯乙烯羧基微球和地高辛抗体，读取吸光度a1数据组，
23、(3)凝集反应后，再次进行吸光度读取a2数据组，并计算每组对应的δa＝a2-a1,
24、(4)若δa>x，则判定样品中存在鲍曼不动杆菌，所述x为实际检测定量限所对应的δa的值；例如δa＞200时，则可以判定该样本为鲍曼不动杆菌阳性。
25、本专利技术的第四方面提供一种对样品中的鲍曼不动杆菌进行相对定量的方法，使用如本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒除包括如权利要求1所述的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述鲍曼不动杆菌。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测；
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种；
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm；
6.一种对样品中是否包含鲍曼不动杆菌进行定性的方法，其特征在于，使用如权利要求2-5任一项所述的试
7.一种对样品中的鲍曼不动杆菌进行相对定量的方法，其特征在于，使用如权利要求2-5任一项所述的试剂盒进行检测，步骤是：
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
10.一种如权利要求1所述的引物对或权利要求2-5中任一项所述的试剂盒在检测样品中鲍曼不动杆菌中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于特异性扩增鲍曼不动杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如seq id no:1所示，所述反向引物的核酸序列如seq id no:2所示。
2.一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒除包括如权利要求1所述的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述鲍曼不动杆菌。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测；
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：林巍靖，段小艳，
申请(专利权)人：上海云泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。