【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物医学检测领域，具体涉及一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)是肠杆菌科细菌中常见的病原菌之一，尤其在菌血症、尿道感染、下呼吸道感染等。由于抗生素选择有限以及高发病率和高死亡率，耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant k.pneumoniae,crkp)遍及全球，成为对公共卫生的主要威胁。前期研究发现，由crkp引起的感染的死亡率为30％～55％，快速可靠地分辨crkp对其传播和流行病学监测至关重要。目前，临床上耐药细菌的检测主要通过纸片扩散法、etest试纸条和自动化微生物系统方法检测药敏试验的结果，或者采用pcr的方法检测耐药基因。常规药敏试验通常需要24h才能报告结果，而pcr的方法虽然用时短但较为繁琐，对实验室要求太高，不适合在临床推广。
2、胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay,petia)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。petia检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后,直接测定反应液的吸光度值,省却了elisa法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。
3、rpa等温扩增技术，也称重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification,rpa)是2006年piepenburg等人利用参与细
技术实现思路
1、本试剂盒在胶乳增强技术的原理上进行创新，利用全自动生化平台上结合核酸等温扩增技术进行了一种全新的尝试。将市面上几乎所有全自动生化仪都自带的恒温孵育模块对核酸样本进行恒温扩增，将扩增后产物(每个扩增产物两端各连接一个生物素)通过与偶联有链霉亲和素的胶乳微球特异性结合形成多个胶乳-扩增产物聚集体，从而形成浊度被生化仪检测到；该技术不但可以快速解决普通核酸检测样本的时间限制，还具备胶乳增强比浊技术的高灵敏特性，从而具备了高灵敏检测核酸分子的能力。为解决现有技术中缺乏检测肺炎克雷伯菌的试剂的问题，本专利技术公开了一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒及其应用。
2、本专利技术通过以下技术方案实现上述问题：
3、本专利技术的第一方面提供一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中，所述试剂盒除包括一对用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述肺炎克雷伯菌；“可以”定义为能够确定所检测的肺炎克雷伯菌的具体浓度。
4、其中，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqid no:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。
5、在本专利技术的一些具体的实施方案中，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有可以与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测。
6、在本专利技术的一些优选实施方案中，所述标记物为生物素，与标记物特异性结合的分子为链霉亲和素。
7、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种。
8、在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括以下一种或多种：
9、(1)所述扩增酶为rpa酶组合，其包括结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶、重组酶辅助因子和肌酸激酶；
10、(2)所述促凝剂选自聚乙二醇、壳聚糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；所述聚乙二醇优选peg25000；
11、(3)所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞和procline 300中的一种或多种；
12、(4)所述封闭剂选自酪蛋白、甘氨酸和bsa中的一种或多种；
13、(5)所述离子稳定剂选自0.4～2％ nacl、kcl和mgcl2中的一种或多种，优选0.9％nacl；
14、(6)所述微球储存液选自50～500mm tris、hepes和pbs缓冲液，ph6.5～7.8；优选100mm pbs，ph 7.4；
15、(7)所述缓冲液为10～500mm tris或pbs，ph 6.5～8.8；优选10mm tris，ph 8.0。
16、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm。
17、优选地，所述试剂盒还包括粒径为147±5nm的聚苯乙烯羧基微球。
18、更优选地，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径分别为88nm、147nm和309nm。
19、本专利技术的第二方面提供一种用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对，其中，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核酸序列如seq id no:1所示，所述反向引物的核酸序列如seq id no:2所示。
20、本专利技术的第三方面提供一种对样品中是否包含肺炎克雷伯菌进行定性的方法，该方法使用如本专利技术第一方面所述的试剂盒进行检测，其包括以下步骤：
21、(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
22、(2)加入不同粒径聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度a1数据组；
23、(3)凝集反应后，再次进行吸光度检测，读取a2数据组，并计算每组对应的δa＝a2-a1；
24、(4)若δa＞x，则判定样品中存在肺炎克雷伯菌，所述x为实际检测定量限所对应δa的值。
25、本专利技术的第四方面提供一种对样品中的肺炎克雷伯菌进行相对定量的方法，该方法使用如本专利技术第一方面所述的试剂盒进行检测，步骤是：
26、(1)使用引物对和扩增酶对样品中的核酸进行扩增；
27、(2)加入不同粒径的聚苯乙烯羧基微球和链霉亲和素，读取吸光度a1数据组；
28、(3)凝集反应后，再次进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒除包括一对用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述肺炎克雷伯菌；
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有能与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测；
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种；
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm；
5.一种用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对，其特征在于，所述引物对包含正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.一种对样品中是否包含肺炎克雷伯菌进行定性的方法，其特征在于，使用如权利要求1-4任一项所述的
7.一种对样品中的肺炎克雷伯菌进行相对定量的方法，其特征在于，使用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行检测，步骤是：
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下条件的一种或多种：
9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球与标记物特异性结合的分子结合包括以下步骤：
10.一种如权利要求5所述的引物对或权利要求1-4中任一项所述的试剂盒在检测样品中肺炎克雷伯菌中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒除包括一对用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对外，还包括至少两种粒径的聚苯乙烯羧基微球，使其在线性范围内可以定量检测所述肺炎克雷伯菌；
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的正向引物和/或反向引物的5’端和/或3’端缀合有标记物；所述聚苯乙烯羧基微球偶联有能与标记物特异性结合的分子，以实现定性和/或定量检测；
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增酶、醋酸镁、促凝剂、防腐剂、封闭剂、离子稳定剂、微球储存液和缓冲液中的一种或多种；
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯羧基微球的粒径为88±5nm和309±5nm；
5.一种用于特异性扩增肺炎克雷伯菌的引物对，其特征在于，所述引...
【专利技术属性】
技术研发人员：林巍靖，段小艳，
申请(专利权)人：上海云泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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