一种野生型IMPDHII蛋白的表达纯化方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体地涉及一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法。本发明专利技术公开了公开了一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法，包含下列步骤：S1.克隆或合成获得含野生型IMPDH II序列的重组核酸片段；S2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；S4.IMPDH II蛋白纯化。本发明专利技术所述方法能能够高效的表达带有8x His标签，TEV酶剪切位点的人野生型IMPDH II蛋白,每升自诱导培养基可收获纯度达90％以上的蛋白350mg以上，比活力可达2左右，置于存储Buffer中，在4℃环境中可存储14天保持活力不降。存储14天保持活力不降。

【技术实现步骤摘要】
一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地涉及一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法。

技术介绍

[0002]肌苷
‑5’‑
单磷酸脱氢酶(inosine 5'
‑
monophosphate dehydrogenase，IMPDH，EC1.2.1.14)是鸟嘌呤生物合成的限速酶。该酶主要与细胞增殖等相关，抑制该酶活性可抑制肿瘤细胞的增殖，因此，该酶是重要的抗肿瘤药物靶标。表达有活性的IMPDH可应用于其抑制的高通量筛选，有助于抗肿瘤药物的筛选以及药物的作用机制研究。
[0003]在人体内主要有两种亚型：IMPDH I和IMPDH II，其中，IMPDH II型特异性的分布于淋巴细胞中，抑制其活性可阻止淋巴细胞的增殖；因此其抑制剂可应用于机体免疫的调节；其抑制剂的应用包括在器官移植后的排异反应控制。表达有活性的IMPDH II蛋白可应用于免疫抑制剂的筛选，有助于排异反应控制药物的筛选和该类药物的作用机制研究。
[0004]野生型IMPDH II的核酸序列和蛋白序列已被公开报道【Natsumeda,Y.,et al.1990J BioZ.Chem.265:5292
‑
5295；Collart,F.R.and Hubermann,E.1988J.Biol.Chem.263:15769
‑
15772；and U.S.Pat.No.5,665,583(SEQ ID NO:63)】，野生型IMPDH II的表达主要依赖于原核表达系统和真核表达系统。在有活性的野生型IMPDH II的表达中，原核表达系统主要用到的表达工程菌株包括：IMPDH缺陷型大肠杆菌H712和常规的大肠杆菌；专利EP 1 559 779 A1公开了利用IMPDH酶缺陷型大肠杆菌H712对IMPDH II和其变体进行表达，可表达获得天然的IMPDH II和其变体，但该方法要用到IMPDH缺陷型表达菌株E.coli H712；而常规的大肠杆菌表达野生型IMPDH II，尤其是带有His标签时大都以包涵体形式存在，导致工艺复杂、蛋白活性较低，目前市售的原核表达的IMPDH II绝大部分是包涵体，只能用于SDS
‑
PAGE实验，没有生物学活性。真核表达系统主要用到HeLa稳转株细胞表达，市售的真核表达的IMPDH II相对比活也比较低，且售价较昂贵。
[0005]大量生产和纯化野生型IMPDH II的能力对于临床应用和研究应用也很重要，如对新的IMPDH II抑制剂的识别和设计，对癌症和免疫抑制疗法以及检测IMPDH II与抑制剂的灵敏度，因此急需一种表达量高、易于纯化、活性高、稳定性强、成本低的获得天然IMPDH II蛋白的方法，以便推广和应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种表达量高、易于纯化、活性高、稳定性强、成本低的获得天然IMPDH II蛋白的方法。
[0007]本专利技术公开了一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法，包含下列步骤：
[0008]S1.克隆或合成获得含野生型IMPDH II序列的重组核酸片段；
[0009]S2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；
[0010]S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行
发酵培养；
[0011]S4.IMPDH II蛋白纯化；
[0012]步骤S3中所述自诱导培养基由下列组分组成：
[0013]α
‑
乳糖：2g/L；葡萄糖：0.5g/L；甘油：5g/L；KH2P04：3.4g/L；
[0014]MgSO4：0.49g/L；蛋白胨：10g/L；Na2HPO
4 3.55g/L；Na2SO4：0.71g/L；
[0015]NH4Cl:2.67g/L；pH 7.4。
[0016]现有重组蛋白大肠杆菌发酵表达中，均需要添加诱导剂，一般为ITPG，才能够诱导基因工程菌中重组蛋白的表达；但是，诱导剂ITPG的添加不仅成本较高，而且会造成重组蛋白的非活性表达，进而影响重组蛋白的活力。本专利技术采用低温自诱导方法，不仅成本低廉，解决了现有技术中IMPDH II重组表达易形成包涵体的问题，而且不会造成IMPDH II的非活性表达，能够显著提高IMPDH II蛋白的活力。
[0017]在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有His标签，其位于IMPDH II核酸序列的N端，以便于后期纯化中镍亲和层析的使用；
[0018]在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有TEV酶剪切位点的核酸序列，其位于His标签序列和IMPDH II核酸序列中间，以便于重组蛋白纯化后，通过TEV酶剪His标签；
[0019]在一优选实施例中，所述重组核酸片段的核酸序列如SEQ ID NO.1。
[0020]在一优选实施例中，所述重组载体为pET
‑
21a(+)、pET
‑
24a(+)、pET
‑
28a(+)、pET
‑
30a(+)或pET
‑
Duet；
[0021]在一优选实施例中，所述宿主细胞为BL21(DE3)或ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21，其中优选为ArcticExpress(DE3)pRare2 BL21；
[0022]在一优选实施例中，所述自诱导培养条件为温度10
‑
20℃，pH7
‑8[0023]在一优选实施例中，所述自诱导培养条件为先37℃培养至菌液OD
600
为3.0
‑
4.0，然后12℃继续培养至菌液OD
600
为14
‑
19。
[0024]在一优选实施例中，所述步骤S4中，所述蛋白纯化步骤：
[0025]a.菌体称重
[0026]b.按照1g湿菌体加入50ml Buffer A的量重悬菌体并使用均质机破碎细胞
[0027]c.使用AKTA Pure蛋白纯化仪和His trap HP预装柱纯化蛋白
[0028]d.透析和超滤浓缩蛋白
[0029]所用溶液如下：
[0030]裂解液：50mM KH2PO4,300mM KCl,20mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；
[0031]洗脱液：50mM KH2PO4,300mM KCl,500mM咪唑,0.8M尿素,pH8.0；
[0032]透析液：50mM KH2PO4,300mM KCl,1mM DTT,0.8M尿素,1mM EDTA,1mM PMSF,pH8.0；
[0033]本专利技术所述方法使采取低温自诱导的方式能够高效的表达带有8 x His标签，TEV酶剪切位点的人野生型IMPDH II蛋白,每升自诱导培养基可收获纯度达90本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种野生型IMPDH II蛋白的表达纯化方法，包含下列步骤：S1.克隆或合成获得含野生型IMPDH II序列的重组核酸片段；S2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；S3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行发酵培养；S4.IMPDH II蛋白纯化；其特征在于，步骤S3中所述自诱导培养基由下列组分组成：α
‑
乳糖：2g/L；葡萄糖：0.5g/L；甘油：5g/L；KH2P04：3.4g/L；MgSO4：0.49g/L；蛋白胨：10g/L；Na2HPO
4 3.55g/L；Na2SO4：0.71g/L；NH4Cl:2.67g/L；pH 7.4。2.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组核酸片段含有His标签，其位于IMPDH II核酸序列的N端。3.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组核酸片段含有TEV酶剪切位点的核酸序列，其位于His标签序列和IMPDH II核酸序列中间。4.如权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组载体为pET
‑
21a(+)、pET
‑
24a(+)、pET
‑
28a(+)、pET
‑
30a(+)或pET
‑
Duet。5.如权利要求4所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组载体为pET
‑
28...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨少青，周超强，洪心珠，逢淑召，
申请(专利权)人：上海云泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：