快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒，所述检测试剂盒由病毒核酸等温扩增试剂和荧光免疫层析定量检测试纸条、运行缓冲液组成。病毒核酸等温扩增试剂包括反应缓冲液、新型冠状病毒ORF1ab（RdRP）、N基因特异性扩增引物和质控品。本发明专利技术的病毒核酸等温扩增反应完成后加入运行缓冲液，混匀滴加到试纸条加样窗口，2分钟后检测荧光信号。本方法可在1小时内完成。本发明专利技术新型冠状病毒检测方法操作简便、安全，灵敏度高、特异性强，有利于实际应用。有利于实际应用。有利于实际应用。

【技术实现步骤摘要】
快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒，属于分子生物学检测技术、侧流层析技术等


技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)属于冠状病毒科β冠状病毒属，但与SARS和MERS冠状病毒有很大不同。SARS
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CoV
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2感染患者通常表现为肺炎样症状和腹泻等胃肠道症状，其次为严重急性期呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至导致死亡。传染源是SARS
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CoV
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2感染患者，包括无症状感染者，以呼吸道飞沫和接触传播为主要传播途径。目前，SARS
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CoV
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2受感染者并无特定的治疗方法，早期诊断以及时管控对于阻止疫情扩散至关重要。
[0003]目前，国内外检测新型冠状病毒方法主要有以下几种：(1)病毒分离。该方法结果准确、可区分活病毒，但操作烦琐、耗费时间长，且只能检测样本中具有感染能力的病毒颗粒，因此灵敏度不足，不利于感染的早期诊断。(2)免疫学检测方法。以免疫胶体金技术为代表的免疫学检测方法(试纸条法)由于操作简便、易于判定等特点适于在基层医疗单位及现场检测中使用，但免疫胶体金法检测具有滞后性，灵敏度和特异性也有待提高。(3)病毒核酸检测。这是目前新冠病毒检测的“金标准”，应用最为广泛的是聚合酶链式反应(PCR)技术。常规PCR检测结果的判断主要依赖于琼脂糖凝胶电泳，耗时较长，且需使用含有一定毒性的核酸染料等试剂，操作安全性有待提高。实时荧光定量PCR可以对靶标进行快速定量检测且无需电泳，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层医疗单位和现场检测中广泛使用。
[0004]根据目前已公开的文献或专利中等温扩增技术包括环介导等温扩增、链替代等温扩增、滚环扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增、交叉引物等温扩增以及重组酶聚合酶扩增及其衍生技术，而且在常规链交换等温扩增方法中，反向引物同时充当反转录引物阻碍了反应进程，削弱了反应效率。
[0005]新型冠状病毒作为一种RNA病毒，极其容易发生碱基突变。目前已知的重要突变包括N501Y、E484K和K417N等，给新型冠状病毒核酸检测带来了挑战。新冠病毒核酸检测的重要靶点序列长度有限，因此能高效扩增短序列的等温扩增方法将具有显著优势。目前，已发表或公开的有关新型冠状病毒等温扩增方法的文献或专利中应用最广泛的是环介导等温扩增技术。但是，该方法需使用4～6条引物进行扩增，且对靶序列及长度有一定的要求。
[0006]因此，本领域亟需开发一种能够准确检测SARS
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CoV
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2，检测时间短、灵敏度高、适于高突变率的靶标、不需要昂贵的设备和试剂且适于现场快速检测的病毒核酸检测方法。这对于有效防止SARS
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CoV
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2的扩散具有极其重要的意义。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：针对现有技术中的在常规链交换等温扩增方法中，反向引物同时充当
反转录引物阻碍了反应进程，削弱了反应效率等问题，本专利技术提供了一种三引物介导的等温扩增引物组以及增强链交换等温扩增方法，其中两条反向引物充当逆转录引物以有效提升针对RNA模板的扩增效率，同时三引物协同作用保证了方法的特异性，且本专利技术的引物和扩增方法相较上述技术具有适于短序列扩增、适用范围广、方法稳定等显著优势。而且本专利技术方法可扩增大于等于30个核苷酸的靶序列，且对目前已知的重要突变株均可有效检测，未来可根据新冠病毒的突变位点灵活调整引物设计，方便快捷、适用性强，具有环介导等温扩增技术等不具备的技术优势。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是提供了等温扩增引物组在制备检测新型冠状病毒试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术最后所要解决的技术问题是针对现有技术在检测新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)和试纸条应用中存在的问题，提供一种快速检测新型冠状病毒的荧光定量试剂盒及检测方法，而且还进一步提供了一种基于新型等温扩增的荧光免疫层析定量检测方法，兼具核酸等温扩增的高效、灵敏、特异性和荧光定量检测结果可数字化判读的优势，有利于实际应用，具有操作便捷、灵敏度高、特异性强、可定量的特点。
[0010]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了等温扩增引物组，所述等温扩增引物组包括Orf1ab基因引物组和/或N基因引物组，所述Orf1ab基因引物组包括正向引物Orf1ab
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F、反向引物Orf1ab
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R和反向引物En
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Orf1ab
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R；所述N基因引物组包括正向引物N
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F、反向引物N
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R和反向引物En
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N
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R，所述正向引物Orf1ab
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F序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物Orf1ab
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R序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物En
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Orf1ab
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R序列如SEQ ID NO：3所示，所述正向引物N
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F序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物N
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R序列如SEQID NO：5所示，所述反向引物En
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N
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R序列如SEQ ID NO：6所示。
[0011]其中，所述正向引物Orf1ab
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F、反向引物Orf1ab
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R和反向引物En
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Orf1ab
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R摩尔比范围为1∶1∶1～1∶3∶3，所述正向引物N
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F、反向引物N
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R和反向引物En
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N
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R摩尔比范围为1∶1∶1～1∶3∶3。
[0012]本
技术实现思路
还包括所述的等温扩增引物组在制备检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。
[0013]本
技术实现思路
还包括一种快速检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的等温扩增引物组。
[0014]其中，所述等温扩增引物组的引物上标记有特定标记物，可选自生物素、地高辛、FAM、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5荧光染料中的一种或几种，使扩增后的DNA产物两端分别含有不同的标记物。
[0015]其中，所述试剂盒还包括等温扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。
[0016]其中，所述阳性对照：新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品；阴性对照：生理盐水。
[0017]其中，所述试剂盒还包括荧光免疫层析定量检测试纸条。
[0018]其中，所述荧光免疫层析定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.等温扩增引物组，其特征在于，所述等温扩增引物组包括Orf1ab基因引物组和/或N基因引物组，所述Orf1ab基因引物组包括正向引物Orf1ab
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F、反向引物Orf1ab
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R和反向引物En
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Orf1ab
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R；所述N基因引物组包括正向引物N
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F、反向引物N
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R和反向引物En
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N
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R，所述正向引物Orf1ab
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F序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物Orf1ab
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R序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物En
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Orf1ab
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R序列如SEQ ID NO：3所示，所述正向引物N
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F序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物N
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R序列如SEQ ID NO：5所示，所述反向引物En
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N
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R序列如SEQ ID NO：6所示。2.根据权利要求1所述的等温扩增引物组，其特征在于，所述正向引物Orf1ab
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F、反向引物Orf1ab
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R和反向引物En
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Orf1ab
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R摩尔比范围为1：1：1 ~ 1：3：3；所述正向引物N
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F、反向引物N
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R和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，庄林林，马明，吉永新，王建国，
申请(专利权)人：徐州淮海生命科学产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：