一种磁性纳米探针介导的血脑屏障转胞吞作用调控方法技术

本发明专利技术公开了ZnFe2O4@CMD纳米颗粒及其磁性纳米探针的制备方法及其应用，本发明专利技术还公开了一种调控血脑屏障(BBB)转胞吞作用的方法。本发明专利技术利用该技术在BBB体外模型及其小鼠体内BBB调控中予以验证。本发明专利技术的方法通过调控BBB中小窝蛋白介导的转胞吞作用增强了分子或纳米颗粒跨越BBB进入脑组织的效率，有望改善脑部疾病治疗药物难以跨越BBB的难题。部疾病治疗药物难以跨越BBB的难题。部疾病治疗药物难以跨越BBB的难题。

【技术实现步骤摘要】
一种磁性纳米探针介导的血脑屏障转胞吞作用调控方法


[0001]本专利技术属于生物与医学纳米材料领域，具体涉及一种磁性纳米探针介导的血脑屏障转胞吞作用调控方法。

技术介绍

[0002]人脑含有约644公里的血管，为脑细胞提供氧气、能量代谢物等，并从大脑中去除二氧化碳和其他代谢废物到体循环。毛细血管约占脑血管长度的85％，是血脑屏障(BBB)的主要发生部位。BBB主要由脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和基底膜等构成，是血液与脑细胞之间的生物界面。其阻挡了近100％的大分子和98％以上的小分子外源性治疗剂，使得中枢神经系统疾病如神经胶质瘤、阿尔兹海默病等的治疗出现瓶颈，严重影响着人民健康。BBB由于以下特殊构造使其难以被突破：(1)血管内皮细胞之间紧密连接蛋白高表达，拥有极高致密性，细胞旁路径被阻断；(2)非特异性内皮细胞转胞吞作用被抑制，跨内皮细胞路径被限制；(3)血管单位基底膜连续无开窗，载体扩散受阻；(4)外周细胞和星形胶质细胞触足围绕血管单位，使BBB结构更稳固。因此，开发BBB调控技术对中枢神经系统的疾病治疗与健康维护有着举足轻重的意义。
[0003]近年来，BBB调控相关研究不断涌现。其中，针对BBB紧密连接蛋白的调控有望打开细胞旁路径。研究人员通过调节BBB血管内皮细胞上Unc5B受体去调控BBB的通透性，调节后的BBB中Wnt/β
‑
连环蛋白信号传导被抑制，进而使得紧密连接蛋白ZO
‑
1和Claudin 5等表达水平降低，这使得分子量小于40kDa的示踪剂可以通过BBB细胞旁路径进入脑组织。相比于细胞旁转运，针对跨细胞转运过程所处的血管内皮细胞的研究具有更多的靶向位点和更广的结合范围。其中，针对BBB血管内皮细胞表面高表达的大中性氨基酸转运体1(LAT1)介导的内吞过程，研究人员合成了表面具有多个游离α
‑
氨基酸基团的碳量子点，通过和LAT1的特异性结合输送，成功穿过BBB高选择性地将抗癌药物靶向递送至神经胶质瘤。针对血管内皮细胞高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)介导的转胞吞过程，研究人员通过LRP1特异性配体将电场响应MRI探针递送至癫痫病灶，在异常脑电刺激下对疾病予以实时成像。
[0004]然而，BBB跨细胞路径的转运，现有多数研究聚焦于血管内皮细胞表面高表达受体，通过模拟蛋白转运过程或者利用受体介导的转胞吞作用跨越BBB。此类研究多受限于血管内皮细胞已有的路径，难以高效转运并模块化设计。因此，针对BBB跨细胞转运过程的特异性调控技术亟待建立。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种ZnFe2O4@CMD纳米颗粒及其磁性纳米探针的制备方法。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述的方法制备得到的ZnFe2O4@CMD纳米颗粒、磁性纳米探针在制备治疗中枢神经系统的疾病的药物中的应用。
[0007]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种磁性纳米探针介导的可调控BBB跨细胞转运过程的方法，为需要跨BBB递药的疾病治疗提供技术支撑。
[0008]技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种ZnFe2O4@CMD纳米颗粒的制备方法，所述ZnFe2O4@CMD纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：将ZnFe2O4磁性纳米颗粒在第一次搅拌条件下将其加入到四甲基氢氧化铵溶液中，继续第二次搅拌，反应结束后去除多余油酸分子，并将产物分散在去离子水中，然后在第三次搅拌条件下将其逐滴加入到CMD水溶液中，反应结束后用纯化即得。
[0009]其中，所述第一次搅拌和第二次搅拌速度为400～600r/min，所述四甲基氢氧化铵溶液的质量浓度为15～30％，继续第二次搅拌时间为20～60min，所述第三次搅拌的速度为600～800r/min，所述CMD水溶液的初始浓度为1～3mg/mL。
[0010]其中，所述ZnFe2O4磁性纳米颗粒的制备中，采用方法为高温热分解法，反应前驱物为乙酰丙酮锌和乙酰丙酮铁，反应溶剂为二苄醚，反应表面活性剂为油酸。
[0011]其中，乙酰丙酮锌用量5～6mmol，乙酰丙酮铁用量为10～12mmol。二苄醚用量为20
‑
22mL，油酸用量为18
‑
22mL。
[0012]其中，加入CMD水溶液的表面修饰过程中，首先用四甲基氢氧化铵进行ZnFe2O4表面油酸替换，后通过CMD与ZnFe2O4之间的Fe
‑
O键将CMD包覆在ZnFe2O4表面，得到ZnFe2O4@CMD磁性纳米颗粒水溶液。
[0013]作为优选，所述四甲基氢氧化铵溶液的质量浓度为20％，CMD和ZnFe2O4的质量比为5∶1。
[0014]本
技术实现思路
还包括一种磁性纳米探针的制备方法，所述磁性纳米探针的制备方法是将制备的ZnFe2O4@CMD纳米颗粒经过活化后加入iRGD多肽分子反应后再经过磁分离纯化后得到。
[0015]其中，所述iRGD多肽分子与ZnFe2O4@CMD纳米颗粒的质量比为0.5～1.5∶10，所述反应条件为室温100～150r/min摇床反应25～60min。
[0016]作为优选，所述iRGD多肽分子的序列为c(CRGDKGPDC)，其通过末端氨基和ZnFe2O4@CMD表面羧基进行偶联。偶联方法为EDC/NHS法，iRGD和ZnFe2O4@CMD的质量比为1∶10。
[0017]本
技术实现思路
还包括所述的方法制备得到的ZnFe2O4@CMD纳米颗粒、所述的方法制备得到的磁性纳米探针。
[0018]本
技术实现思路
还包括所述的ZnFe2O4@CMD纳米颗粒或磁性纳米探针在制备治疗中枢神经系统的疾病的药物中的应用，作为优选地，所述应用包括将磁性纳米探针靶向血脑屏障调控转胞吞作用。
[0019]本
技术实现思路
还包括一种血脑屏障转胞吞作用调控方法，包括如下步骤：
[0020]1)所述的方法制备磁性纳米探针；
[0021]2)构建BBB体外模型；
[0022]3)将BBB体外模型置于低频交变磁场发生器中，开启磁场一定时间后完成BBB转胞吞作用调控。
[0023]其中，步骤2)中BBB模型构建所用内皮细胞为bEnd.3，星形胶质细胞为C8
‑
D1A，加入的磁性纳米探针质量为50
‑
150μg/孔，靶向所需时间为0.5
‑
1.5h。
[0024]其中，步骤3)中所述低频交变磁场控制器基本参数范围为磁场强度：10
‑
100Oe，频
率为10
‑
50Hz，线圈参数为匝数10
‑
100匝，直径为5
‑
15em，循环水冷却。
[0025]其中，步骤3)所述低频交变磁场的作用时间为1
‑
30min。
[0026]在本专利技术的步骤3)之后还包括采用FITC
‑
Dextran本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ZnFe2O4@CMD纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将ZnFe2O4磁性纳米颗粒在第一次搅拌条件下将其加入到四甲基氢氧化铵溶液中，继续第二次搅拌，反应结束后去除多余油酸分子，并将产物分散在去离子水中，然后在第三次搅拌条件下将其逐滴加入到CMD水溶液中，反应结束后用纯化即得。2.根据权利要求1所述的ZnFe2O4@CMD纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述第一次搅拌和第二次搅拌速度为400～600r/min，所述四甲基氢氧化铵溶液的质量浓度为15～30％，继续第二次搅拌时间为20～60min，所述第三次搅拌的速度为600～800r/min，所述CMD水溶液的初始浓度为1～3mg/mL。3.一种磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述磁性纳米探针的制备方法是将权利要求1或2制备的ZnFe2O4@CMD纳米颗粒经过活化后加入iRGD多肽分子反应后再经过磁分离纯化后得到。4.根据权利要求3所述的磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述iRGD多肽分子与ZnFe2O4@CMD纳米颗粒的质量比为0.5～1.5∶10，所述反应条件为室温100～150r/min摇床反应25～60min。5.权利要求1或2所述的方法制备得到的ZnFe2O4@CMD纳米颗粒、权利要求3或4所述的方法制备得到的磁性纳米探针。6.权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：武昊安，张宇，马明，王建国，
申请(专利权)人：徐州淮海生命科学产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：