核酸极短PCR扩增的方法、检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及核酸极短PCR扩增方法、检测方法及应用。该扩增方法包括，使用引物对及用于扩增的模板分子，通过PCR扩增从样品中核酸分子制造含有特定碱基序列的扩增产物；引物对包括pg引物和ph引物，pg引物为长度小于14nt且5

【技术实现步骤摘要】
核酸极短PCR扩增的方法、检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，尤其涉及一种核酸极短PCR扩增的 方法、检测方法及应用。

技术介绍

[0002]核酸作为遗传信息的载体，提供了大量的生物学信息，核酸检测 (NAD)已应用到许多疾病诊检测中，尤其是对于传染病的突然爆发， 核酸检测可以迅速确定感染。因此，人们一直追求快速，高度灵敏和高 度特异性的核酸检测方法。目前，最常见的核酸检测方法仍然是PCR及 其一些衍生方法，因为它具有很高的灵敏度，例如qPCR，ddPCR等。这 些方法已应用于核酸检测的各个方面，在大规模传染性疾病肆虐时发挥 了巨大作用。但是在应用过程中也发现一些不足，比如qPCR和ddPCR 一般要2
‑
4小时左右耗时较长，对荧光定量PCR仪和数字PCR仪等昂贵 仪器的的依赖性较高等。虽然已经有多种优良的核酸检测的方法，但人 们仍然致力于从时间，灵敏度，特异性，成本，多样性和其他方面开发 新的检测方法。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术利用Taq DNA聚合酶进行极短PC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸极短PCR扩增的方法，其特征在于，使用引物对及用于扩增的模板分子，通过PCR扩增从样品中核酸分子制造含有特定碱基序列的扩增产物；其中，所述引物对包括pg引物和ph引物，所述pg引物为长度小于14nt且5
’
端经磷酸基团修饰的单链DNA分子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物对是根据目的基因的单核苷酸多态性位点而设计，所述pg引物和所述ph引物长度均在11nt～13nt之间，所述pg引物和所述ph引物的Tm值均小于40℃。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述模板分子为单链DNA分子和双链DNA分子中的至少一种。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，扩增条件为70℃1s、40℃1s，30～50个循环。5.一种核酸检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、利用权利要求1
‑
4任一项所述的方法扩增目标样品，得到长度大于15nt的核酸扩增产物；S2、在含有PfAgo酶和分子信标的反应体系中，利用所述核酸扩增产物介导PfAgo酶切割分子信标，检测切割过程中产生的荧光信号，以获取所述目标样品中核酸分子的荧光值；S2步骤中，所述pg引物与所述分子信标互补。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S2步骤在如下反应体系下进行：PfAgo酶，2μl，分子信标，1μl，10
×
PfAgo反应缓冲液，1μl，所述S1步骤扩增产物，5μl，加ddH2O至10μl；反应条件为：95℃、30min；其中，10
×
PfAgo反应缓冲液配方为：20mM HEPES(pH7.5)、250mM NaCl和0.5mM MnCl2。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述目标核酸分子可为单链DNA分子ssDNA，来自SARS
‑
CoV
‑
2的单链DNA分子ssDNA
‑
OS2，来自MERS的单链DNA分子ssDNA
‑
OM，来自SARS
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CoV的单链DNA分子ssDNA
‑
OS，来自SARS
‑
CoV
‑
2的单核苷酸多态性位点的单链DNA分子nt8782C、nt8782T、nt28144T和nt28144C，来自VP72基因的VP72分子和来自HPV16的L1基因的DNA分子中的至少一种；其中，ssDNA1、ssDNA
‑
OS2、ssDNA
‑
OM、ssDNA
‑
OS、nt8782C、nt8782T，nt28144T、nt28144C、VP72和L1对应的序列依次为：ssDNA1：5
’‑
AGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGCAATGGCGGTGATGCTGCTC
‑3’
，如SEQ ID NO.1所示；ssDNA
‑
OS2：5
’‑
ACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCG
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示；ssDNA
‑
OM：5
’‑
AGCAGCACTGCCCCAATCTAAAGATTCCAAT
‑3’
，如SEQ ID NO.3所示；
ssDNA
‑
OS：5
’‑
ACCCTTGATGCAGTCTGCGGATGCATCAACG
‑3’
，如SEQ ID NO.4所示；nt8782C：5
’‑
ACTACCACCACGCTGGCTAAACCATGTGTCA
‑3’
，如SEQ ID NO.5所示；nt8782T：5
’‑
ACTACCACCACGCTGACTAAACCATGTGTCA
‑3’
，如SEQ ID NO.6所示；nt28144T：5
’‑
GCAATTAATTGTAAAAGGTAAACAGGAAACTGTAT
‑3’
，如SEQ ID NO.7所示；nt28144C：5
’‑
GCAATTAATTGTAAAAGGTGAACAGGAAACTGTAT
‑3’
，如SEQ ID NO.8所示；VP72：5
’‑
CTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACC
‑3’
，如SEQ ID NO.9所示；L1：5
’‑
AAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATAC
‑3’
，如SEQ ID NO.10所示。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，ssDNA1、ssDNA
‑
OS2、ssDNA
‑
OM、ssDNA
‑
OS、nt8782C/T、nt28144C/T、VP72和L1靶向序列对应的引物依次为：pg1：5
’
P
‑
CCATTGCCAGC
‑3’
，如SEQ ID NO.11所示；ph1：5
’
CTTCTCCTGCTAGA
‑3’
，如SEQ ID NO.12所示；OS2
‑
pg：5
’
P
‑
GCTTCAGTCAG
‑3’
，如SEQ ID NO.13所示；OS2
‑
ph：5
’
ATTGTGCATCAG
‑3’
，如SEQ ID NO.14所示；OM
‑
pg：5
’
P
‑
ACTGCCCCAAT
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立新，何如怡，王珑瑜，王飞，李春华，赵帅，余晓，刘琳琳，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：