一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法及其应用技术

本产品涉及生物工程领域，尤其涉及一种重组丝氨酸蛋白酶的制备及其应用：具体通过PCR技术克隆了丝氨酸蛋白酶(PmSpr)基因，并构建了重组工程菌株BL21/pET‑PmSpr，将获得的重组工程菌进行低温诱导，最终收集菌体经纯化了得到重组丝氨酸蛋白酶；本发明专利技术制备的重组丝氨酸蛋白酶具有很好的鱼肉蛋白水解性能，以花鲢鱼肉蛋白为水解底物，制备了具有抗氧化活性的酶解产物，其DPPH的IC50为1.087mg/mL，为水产品的精加工提供了理论基础和方法，对食品医药行业的发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法及其应用
本产品涉及生物工程领域，尤其涉及一种重组丝氨酸蛋白酶的制备及其应用。
技术介绍
蛋白酶是水解蛋白质、多肽的一类酶的总称，应用非常广泛(食品、洗涤、医药、饲料等)，占全球酶制剂销量总额的六成以上。蛋白酶按来源可分为动植物和微生物来源蛋白酶，其中，微生物来源蛋白酶由于具有制备简便、制备成本低等特点，应用最为广泛。近年，我国水产养殖行业发展迅猛，但精加工产品较少以及综合利用率和附加值低等问题，造成了大量蛋白质资源的浪费。因此，寻找可用于鱼肉水解生产活性肽的微生物来源蛋白酶非常必要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新型丝氨酸蛋白酶的制备及其应用，该蛋白酶可以实现对花鲢鱼肉蛋白的水解，并制备了具有抗氧化活性的酶解产物，为利用微生物蛋白酶进行水产品精深加工提供了理论方法和基础。本专利技术基于PlanococcusdechangensisXJ11的基因组获得了一种重组丝氨酸蛋白酶，其基因序列如SEQIDNO.1，基因大小为990bp，其氨基酸序列SEQIDNO.2所示，由329个氨基酸残本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法的制备方法，其特征在于，步骤如下：/n(1)取菌株Planococcus dechangensis XJ11经活化培养后，离心收集菌体，用CTAB法提取Planococcus dechangensis XJ11的基因组DNA；/n(2)基于丝氨酸蛋白酶的基因序列，设计特异性PCR扩增上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4，其中上游引物中CATATG和下游引物中CTCGAG分别为BamH I和Xho I酶切位点，pET-22b(+)质粒的上下游同源臂分别为TAAGAAGGAGATATA和GTGGTGGTGG TGGTG；/n以步骤(1)中...

【技术特征摘要】
1.一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取菌株PlanococcusdechangensisXJ11经活化培养后，离心收集菌体，用CTAB法提取PlanococcusdechangensisXJ11的基因组DNA；
(2)基于丝氨酸蛋白酶的基因序列，设计特异性PCR扩增上游引物SEQIDNO.3和下游引物SEQIDNO.4，其中上游引物中CATATG和下游引物中CTCGAG分别为BamHI和XhoI酶切位点，pET-22b(+)质粒的上下游同源臂分别为TAAGAAGGAGATATA和GTGGTGGTGGTGGTG；
以步骤(1)中获得的PlanococcusdechangensisXJ11基因组DNA为模板，PCR扩增使用酶为Q5超保真聚合酶，来扩增丝氨酸蛋白酶基因序列，得到PCR扩增产物；
(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)中PCR扩增产物的大小，利用胶回收的方式将990bp的条带进行回收，得到回收的PCR产物；
(4)利用一步克隆的方法将步骤(3)中回收的PCR产物与线性化后的质粒pET-22b(+)进行连接，构建得到重组表达质粒，并将重组质粒导入大肠杆菌BL-21(DE3)化学感受态细胞中，以获得重组工程菌；
(5)将步骤(4)得到的重组工程菌接种至LB液体培养基中，培养至OD600为0.6～1.0时，加入诱导剂IPTG进行过夜诱导；取诱导后的菌液，离心收集菌体，并将菌体重悬于Tris-HCl缓冲液，得到菌体悬浮液；然后在冰浴条件下对菌体悬浮液进行超声破碎，超声破碎处理后离心收集上清液，利用亲和层析NI-NTA柱对上清液进一步纯化，获得重组丝氨酸蛋白酶。


2.根据权利要求1所述的重组丝氨酸蛋白酶的制备方法的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述菌株PlanococcusdechangensisXJ11保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2019年1月2日，编号为CGMCCNO.17059。


...

【专利技术属性】
技术研发人员：高瑞昌，冷伟军，周晶，袁丽，周越，齐向辉，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32