编码因子IX的核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸，其中因子IX核苷酸序列包含编码因子IX蛋白或其片段的编码序列，并且其中编码序列的一部分不是野生型的。本发明专利技术还涉及包含含有本发明专利技术的多核苷酸的重组基因组的病毒颗粒，包含所述多核苷酸或病毒颗粒的组合物，以及所述多核苷酸、病毒颗粒或组合物的方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码因子IX的核苷酸专利
本专利技术涉及包含编码因子IX的核苷酸序列的多核苷酸，包含该多核苷酸的病毒颗粒以及利用该多核苷酸的治疗。专利技术背景B型血友病(一种X连锁的威胁生命的出血性疾病)影响1：30,000的男性。目前的治疗涉及频繁静脉注射(每周2-3次)因子IX(FIX)蛋白。这种治疗在止血方面非常有效，但其不是治愈性的，而且非常昂贵(每位患者每年150,000英镑)，因此使得其是世界上大多数B型血友病患者所无法承受的。B型血友病的基因疗法通过在将因子IX基因的功能拷贝转移到患病患者后因子IX的持续的内源性产生而提供了治愈的潜力。本申请涉及用于治疗B型血友病的基因治疗方法，其涉及施用包含编码因子IX的多核苷酸的载体。这样的基因治疗方法可避免频繁静脉注射因子IX的需要。但是，提供有效的基因治疗载体(即允许高水平的因子IX表达和高活性的因子IX的表达的载体)是困难的。专利技术概述本申请证明了对包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸的各种修饰能够帮助改善表达的因子IX多肽的表达水平和活性。例如，本申请证明了以下能够改善包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸治疗B型血友病的功效：·使用经密码子优化的序列；·保留因子IX多肽的未经密码子优化的一部分；·包括内含子或内含子片段；·`提供在内含子或内含子片段侧翼的未经密码子优化的序列；·使用功能获得突变；·使用特定的启动子；和/或·保持单链形式的包含所述核苷酸的AAV基因组。这些修饰提供了这样的因子IX序列，其是高表达的并且其编码高活性的因子IX多肽或其片段。如实施例所证明的，本专利技术的多核苷酸以比其他编码因子IX的多核苷酸(例如WO16/075473中公开的那些)更高水平的表达和提供总体因子IX活性。因此，在本专利技术的第一方面，提供了包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸，其中因子IX核苷酸序列包含编码因子IX蛋白或其片段的编码序列，并且其中编码序列的一部分不是野生型的。在本专利技术的第二方面，提供了包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸，其中所述因子IX核苷酸序列包含编码因子IX蛋白或其片段的编码序列，并且所述编码序列包含：(i)与SEQIDNO：1至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列；(ii)与SEQIDNO：15至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％相同的序列。在本专利技术的第三方面，提供了包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸，其中所述因子IX核苷酸序列编码因子IX蛋白或其片段，并与SEQIDNO：5具有至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或100％的同一性。在本专利技术的第四方面，提供了包含重组基因组的病毒颗粒，所述重组基因组包含本专利技术的多核苷酸。在本专利技术的第五方面，提供了包含本专利技术的多核苷酸或病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂的组合物。在本专利技术的第六方面，提供了一种治疗方法，其包括向患者施用有效量的本专利技术的多核苷酸或病毒颗粒。在本专利技术的第七方面，提供了本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物在制备用于治疗方法的药物中的用途。在第八方面，本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于以由包含SEQIDNO：12的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：7的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽，从而治疗疾病。在第九方面，本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物通过以由包含SEQIDNO：12的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：7的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽来治疗疾病。在第十方面，提供了一种以由包含SEQIDNO：12的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：7的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽的方法，包括向患者施用本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物。在第十一方面，提供了一种通过以由包含SEQIDNO：12的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：7的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽来治疗疾病的方法，包括向患者施用本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物。在第十二方面，提供了本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于以由包含SEQIDNO：12的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：7的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽的用途，从而治疗疾病。在第十三方面，提供了本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于通过以由包含SEQIDNO：12的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：7的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽来治疗疾病的用途。在第十四方面，本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于以由包含SEQIDNO：18的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：6的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽，从而治疗疾病。在第十五方面，本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于通过以由包含SEQIDNO：18的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：6的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽来治疗疾病。在第十六方面，提供了一种以由包含SEQIDNO：18的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：6的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽的方法，包括将本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物施用至患者。在第十七方面，提供了一种通过以由包含SEQIDNO：18的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：6的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽来治疗疾病的方法，包括将本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物施用至患者。在第十八方面，提供了本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于以由包含SEQIDNO：18的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：6的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽的用途，从而治疗疾病。在第十九方面，提供了本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于通过以由包含SEQIDNO：18的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：6的转录调节元件的核苷酸序列编码的多肽的至少2倍或至少3倍的水平表达由因子IX核苷酸序列编码的多肽来治疗疾病的用途。在第二十方面，本专利技术的多核苷酸、病毒颗粒或组合物用于通过表达具有比由包含SEQIDNO：12的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：7的转录调节元件的病毒颗粒和/或包含SEQIDNO：18的因子IX核苷酸序列和SEQIDNO：6的转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸，其中：/n(i)因子IX核苷酸序列包含编码因子IX蛋白或其片段的编码序列；/n(ii)编码序列的一部分是经密码子优化的；/n(iii)经密码子优化的编码序列的部分的长度为至少1100个核苷酸；/n(iv)在经密码子优化的部分中，至少60％的密码子选自TTC、CTG、ATC、GTG、GTC、AGC、CCC、ACC、GCC、TAC、CAC、CAG、AAC、AAA、AAG、GAC、TGC、AGG、GGC和GAG；/n(v)与SEQ ID NO：9的相应部分相比，经密码子优化的部分包含减少数量的CpG；/n(vi)所述多核苷酸还包含转录调节元件，所述转录调节元件包含：/n(a)A1AT启动子或A1AT启动子的片段；和/或/n(b)HCR增强子或HCR增强子的片段；和/n(vii)因子IX核苷酸序列在对应于野生型因子IX的位置384的位置处包含编码亮氨酸的密码子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180820 GB 1813528.5;20180820 US 16/105,5831.一种包含因子IX核苷酸序列的多核苷酸，其中：
(i)因子IX核苷酸序列包含编码因子IX蛋白或其片段的编码序列；
(ii)编码序列的一部分是经密码子优化的；
(iii)经密码子优化的编码序列的部分的长度为至少1100个核苷酸；
(iv)在经密码子优化的部分中，至少60％的密码子选自TTC、CTG、ATC、GTG、GTC、AGC、CCC、ACC、GCC、TAC、CAC、CAG、AAC、AAA、AAG、GAC、TGC、AGG、GGC和GAG；
(v)与SEQIDNO：9的相应部分相比，经密码子优化的部分包含减少数量的CpG；
(vi)所述多核苷酸还包含转录调节元件，所述转录调节元件包含：
(a)A1AT启动子或A1AT启动子的片段；和/或
(b)HCR增强子或HCR增强子的片段；和
(vii)因子IX核苷酸序列在对应于野生型因子IX的位置384的位置处包含编码亮氨酸的密码子。


2.前述权利要求的多核苷酸，其中经密码子优化的编码序列的部分是经密码子优化以用于在人肝中表达。


3.前述权利要求中任一项的多核苷酸，其中：
(i)由因子IX核苷酸序列编码的多肽在人肝细胞中以与参考野生型因子IX核苷酸序列相比更高的水平表达；和/或
(ii)经密码子优化的编码序列的部分的长度为至少800、至少900、至少1100、少于1500、少于1300、少于1200、800至1500、900至1300、1100至1200或约1191个核苷酸；和/或
(iii)经密码子优化的编码序列的部分包含以下的1、2、3、4、5种或全部：
a)外显子3或外显子3的至少10、至少15、至少20、少于25、10至25、15至25或20至25个核苷酸的部分；
b)外显子4或外显子4的至少80、至少90、至少100、少于114、80至114、90至114或100至114的核苷酸的部分；
c)外显子5或外显子5的至少90、至少100、至少110、少于129、90至129、100至129或110至129个核苷酸的部分；
d)外显子6或外显子6的至少150、至少180、至少200、少于203、150至203、180至203或200至203个核苷酸的部分；
e)外显子7或外显子7的至少70、至少80、至少90、至少100、少于115、70至115、80至115、90至115或100至115个核苷酸的部分；和/或
f)外显子8或外显子8的至少400、至少450、至少500、少于548、400至548、450至548或500至548个核苷酸的部分；和/或
(iv)经密码子优化的编码序列的部分包含外显子3的至少20个核苷酸的部分、外显子4的至少100个核苷酸的部分、外显子5的至少110个核苷酸的部分、外显子6的至少180个核苷酸、外显子7的至少100个核苷酸的部分和外显子8的至少500个核苷酸的部分；和/或
(v)经密码子优化的编码序列的部分包含外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8；和/或
(vi)经密码子优化的编码序列的部分包含外显子2的一部分，外显子2的该部分的长度为少于160、少于150、少于100、少于75、少于60、至少20、至少30、至少40、至少50、20至160、30至150、30至100、40至75或约56个核苷酸；和/或
(vii)经密码子优化的编码序列的部分包含长度为30至100个核苷酸的外显子2的一部分。


4.前述权利要求中任一项的多核苷酸，其中：
(i)经密码子优化的编码序列的部分包含少于40、少于20、少于18、少于10、少于5或少于1个CpG；和/或
(ii)经密码子优化的编码序列的部分不含CpG。


5.前述权利要求中任一项的多核苷酸，其中在经密码子优化的编码序列的部分中：
(i)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2、至少4或至少5个编码苯丙氨酸的密码子被TTC取代；
b)至少60％、至少65％或至少70％的编码苯丙氨酸的密码子是TTC；
c)至少60％、至少65％或至少70％的编码苯丙氨酸的密码子是TTC，其余是TTT；和/或
d)编码苯丙氨酸的密码子是TTC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(ii)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少10、至少15或至少16个编码亮氨酸的密码子被CTG取代；
b)至少90％或至少94％的编码亮氨酸的密码子是CTG；和/或
c)至少90％或至少94％的编码亮氨酸的密码子是CTG，其余是CTC；和/或
(iii)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少10、至少11或至少12个编码异亮氨酸的密码子被ATC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少一个ATC密码子被ATT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少60％、至少70％或至少75％的编码异亮氨酸的密码子是ATC；
d)至少60％、至少70％或至少75％的编码异亮氨酸的密码子是ATC，其余是ATT；和/或
e)编码异亮氨酸的密码子是ATC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(iv)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少10、至少15、至少20或至少25个编码缬氨酸的密码子被GTG取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个编码缬氨酸的密码子被GTC取代；
c)至少80％、至少90％或至少95％的编码缬氨酸的密码子是GTG；和/或
d)至少80％、至少90％或至少95％的编码缬氨酸的密码子是GTG，其余是GTC；和/或
(v)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少10、至少12或至少13个编码丝氨酸的密码子被AGC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2或至少4个编码丝氨酸的密码子被TCT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少60％、至少65％或至少70％的编码丝氨酸的密码子是AGC；和/或
d)至少60％、至少65％或至少70％的编码丝氨酸的密码子是AGC，其余是TCT或TCC；和/或
(vi)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2或至少5个编码脯氨酸的密码子被CCC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个编码脯氨酸的密码子被CCT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少50％、至少55％或至少60％的编码脯氨酸的密码子是CCC；
d)50％、至少55％或至少60％的编码脯氨酸的密码子为CCC，其余是CCA或CCT；和/或
e)编码脯氨酸的密码子是CCC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(vii)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少6、至少7、至少8或至少10个编码苏氨酸的密码子被ACC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1或至少2个编码苏氨酸的密码子被ACT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少45％、至少50％或至少55％的编码苏氨酸的密码子是ACC；
d)至少45％、至少50％或至少55％的编码苏氨酸的密码子是ACC，其余是ACT；和/或
e)编码苏氨酸的密码子是ACC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(viii)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2、至少3或至少4个编码丙氨酸的密码子被GCC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2或至少3个编码丙氨酸的密码子被GCT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少35％、至少40％或至少43％的编码丙氨酸的密码子是GCC；
d)至少35％、至少40％或至少45％的编码丙氨酸的密码子是GCC，其余是GCT；和/或
e)编码丙氨酸的密码子是GCC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(ix)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1或至少2个编码酪氨酸的密码子被TAC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个TAC密码子被TAT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少40％、至少45％或至少48％的编码酪氨酸的密码子是TAC；
d)至少40％、至少45％或至少48％的编码酪氨酸的密码子是TAC，其余是TAT；和/或
e)编码酪氨酸的密码子是TAC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(x)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个编码组氨酸的密码子被CAC取代；
b)至少50％、至少60％或至少65％的编码组氨酸的密码子是CAC；
c)至少50％、至少60％或至少65％的编码组氨酸的密码子是CAC，其余是CAT；和/或
d)编码组氨酸的密码子是CAC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(xi)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2、至少4或至少5个编码谷氨酰胺的密码子被CAG取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个CAG密码子被CAA取代；
c)至少80％、至少85％或至少90％的编码谷氨酰胺的密码子是CAG；和/或
d)至少80％、至少85％或至少90％的编码谷氨酰胺的密码子是CAG，其余是CAA；和/或
(xii)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2、至少4或至少5个编码天冬酰胺的密码子被AAC取代；
b)至少60％、至少65％或至少70％的编码天冬酰胺的密码子是AAC；
c)至少60％、至少65％或至少70％的编码天冬酰胺的密码子是AAC，其余是AAT；和/或
e)编码天冬酰胺的密码子是AAC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(xiii)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少7、至少8或至少9个编码赖氨酸的密码子被AAG取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个AAG密码子被AAA取代；
c)至少80％、至少90％或至少95％的编码赖氨酸的密码子是AAG；和/或
d)至少80％、至少90％或至少95％的编码赖氨酸的密码子是AAG，其余的是AAA；和/或
(xiv)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少1、至少2、至少3或至少4个编码天冬氨酸的密码子被GAC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，其中至少1个GAC密码子被GAT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少45％、至少50％或至少60％的编码天冬氨酸的密码子是GAC；
d)至少45％、至少50％或至少60％的编码天冬氨酸的密码子是GAC，其余是GAT；和/或
e)编码天冬氨酸的密码子是GAC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(xv)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少15、至少20、至少25或至少26个编码谷氨酸的密码子被GAG取代；
b)至少80％、至少90％或至少95％的编码谷氨酸的密码子是GAG；和/或
c)至少80％、至少90％或至少95％的编码谷氨酸的密码子是GAG和其余的是GAA；和/或
(xvi)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少6、至少7或至少8个编码半胱氨酸的密码子被TGC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个TGC密码子被TGT取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少40％、至少50％或至少55％的编码半胱氨酸的密码子是TGC；
d)至少40％、至少50％或至少55％的编码半胱氨酸的密码子是TGC，其余是TGT；和/或
e)编码半胱氨酸的密码子是TGC，除非下一个密码子以G开头；和/或
(xvii)编码色氨酸的密码子是TGG；和/或
(xviii)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少8、至少10或至少11个编码精氨酸的密码子被AGG取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少1个编码精氨酸的密码子被AGA取代；
c)至少60％、至少70％或至少75％的编码精氨酸的密码子是AGG；和/或
d)至少60％、至少70％或至少75％的编码精氨酸的密码子是AGG，其余是AGA；和/或
(xix)a)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少10、至少12或至少13个编码甘氨酸的密码子被GGC取代；
b)与参考野生型因子IX序列相比，至少5、至少6、至少7或至少8个编码甘氨酸的密码子被GGG取代，其中下一个密码子以G开头；
c)至少50％、至少55％或至少60％的编码甘氨酸的密码子是GGC；
d)至少50％、至少55％或至少60％的编码甘氨酸的密码子是GGC，其余的是GGG；和/或
e)编码甘氨酸的密码子是GGC，除非下一个密码子以G开头。


6.前述权利要求中任一项的多核苷酸，其中经密码子优化的编码序列的部分包含编码苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、色氨酸、精氨酸和甘氨酸的密码子，并且在密码子优化的部分中：
a)与参考野生型因子I...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·纳斯瓦尼，J·麦金托什，
申请(专利权)人：UCL商业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB