表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法技术

技术编号:28607950 阅读:129 留言:0更新日期:2021-05-28 16:01
本发明专利技术涉及生物医药领域,特别涉及表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法。本发明专利技术根据铁蛋白自组装特性,将新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)与铁蛋白相连,构建了表达新型冠状病毒受体结合域(RBD)的重组铁蛋白纳米颗粒。RT‑PCR及Western Blot结果显示重组杆状病毒构建成功并且可以表达外源蛋白RBD‑HF。经透射电镜观察,电镜下可以看到20‑40nm的纳米颗粒,证明本发明专利技术成功构建了呈现SARS‑CoV‑2RBD的重组铁蛋白纳米颗粒,为之后的疫苗研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法
本专利技术涉及生物医药领域,特别涉及表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法。
技术介绍
SARS-CoV-2属于β冠状病毒属,已有研究发现其特异性受体为血管紧张素转化酶2(Angiotensinconvertingenzyme2,ACE2),与之结合的病毒蛋白区域为受体结合域(ReceptorBindingDomain,RBD)。疫苗对这一病毒的防控将起着至关重要的作用。根据世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)数据显示,截至2020年12月8日,共有52款候选疫苗进入临床试验,另有162款疫苗正在临床前研究,开发一款安全有效的候选疫苗仍是当前的紧迫任务。颗粒疫苗可以使目的蛋白更加接近天然构象,到目前为止,研究最多的自组装蛋白纳米颗粒包括病毒样颗粒(Viruslikeparticle)、血清白蛋白(Serumalbumin)、丝蛋白(Silkprotein)以及铁蛋白(Ferritin)。铁蛋白结构稳定,可以耐受高温和多种变性剂,铁蛋白外表面可以通过基因融合的方法进行修饰,从而表达并呈递外源蛋白。目前已报道的使用铁蛋白为纳米颗粒载体的病毒有:EB病毒、丙肝病毒(HepatitisCvirus,HCV)、人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)、流感病毒(Influenza)等。因此,提供一种表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术以铁蛋白为纳米颗粒载体,通过杆状病毒表达系统,构建了呈现SARS-CoV-2RBD的重组铁蛋白纳米颗粒,为接下来的研究奠定了基础。为了实现上述专利技术目的,本专利技术提供以下技术方案:本专利技术提供了表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒,将新型冠状病毒受体结合域和铁蛋白的重组片段连接至载体,转化感受态细胞获得重组杆粒,转染至细胞收获重组杆状病毒。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述载体为pFastBacDual载体;所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞;所述细胞为sf9细胞。本专利技术还提供了所述的重组铁蛋白纳米颗粒的制备方法,将新型冠状病毒受体结合域和铁蛋白的重组片段连接至载体,转化细胞获得重组杆粒,转染至细胞收获重组杆状病毒。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述载体为pFastBacDual载体;所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞;所述细胞为sf9细胞。本专利技术还提供了所述的重组铁蛋白纳米颗粒或所述制备方法制得的重组铁蛋白纳米颗粒在制备新型冠状病毒受体结合域和铁蛋白的重组蛋白、疫苗或新型冠状病毒研究中的应用。此外,本专利技术还提供了重组蛋白,由所述的重组铁蛋白纳米颗粒或所述制备方法制得的重组铁蛋白纳米颗粒表达。基于上述研究,本专利技术还提供了所述的重组蛋白在制备治疗病症或疾病的药物中的用途;所述病症或疾病包括新型冠状病毒所致的病症或疾病。更重要的是,本专利技术还提供了所述的重组蛋白制得的疫苗。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述疫苗还包括药学上可接受的保护剂、稳定剂、佐剂、稀释剂、载体或辅料。本专利技术还提供了所述的疫苗在制备治疗病症或疾病的药物中的用途;所述病症或疾病包括新型冠状病毒所致的病症或疾病。本专利技术根据铁蛋白自组装特性,将新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与铁蛋白相连,构建了表达新型冠状病毒受体结合域(RBD)的重组铁蛋白纳米颗粒。本专利技术将SARS-CoV-2RBD与铁蛋白重组片段连接至pFastBacDual载体pH启动子之下,转化到DH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒,经转染贴壁sf9细胞后获得重组杆状病毒。RT-PCR及WesternBlot结果显示重组杆状病毒构建成功并且可以表达外源蛋白RBD-HF。经透射电镜观察,电镜下可以看到20-40nm的纳米颗粒,证明本专利技术成功构建了呈现SARS-CoV-2RBD的重组铁蛋白纳米颗粒,为之后的疫苗研究奠定了基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示rBD-SARS-CoV2-RBD-HF示意图;图2示重组杆粒RT-PCR鉴定;其中,M:DL5000MARKER;1-2:rBD-SARS-CoV2-RBD-HF;3:水;4:空载体重组杆粒;图3示重组杆状病毒感染sf9细胞病变观察(200×);其中,A:正常sf9细胞;B:sf9细胞感染rBDV-SARS-CoV2-RBD-HF后48h;C:sf9细胞感染rBDV-SARS-CoV2-RBD-HF后72h;图4示重组杆状病毒RT-PCR鉴定;其中,M:DL2000MARKER;1-2:rBDV-SARS-CoV2-RBD-HF;3:pFastBacDual;4:MOCK(DH10Bac);5:水;图5示WesternBlot鉴定重组杆状病毒外源基因表达;其中,M:蛋白MARKER;1:蛋白RBD-HF;2:MOCK;图6示重组铁蛋白纳米颗粒电镜下观察。具体实施方式本专利技术公开了表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本专利技术技术。铁蛋白存在于大多数生物体内,可以具有自组装的特性。本专利技术将SARS-CoV-2RBD与铁蛋白融合,根据铁蛋白的特性,通过杆状病毒表达系统,构建了呈递SARS-CoV-2RBD的重组铁蛋白纳米颗粒。经RT-PCR、WesternBlot及透射电镜鉴定,证明了SARS-CoV-2成功表达并自组装成为纳米颗粒,我们接下来将对这一重组铁蛋白纳米颗粒进行免疫原性研究。本专利技术提供的表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒及其构建方法中,所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例,进一步阐述本专利技术:质粒、细胞、菌株:SARS-CoV-2RBD-HF基因序列(如SEQIDNo.1所示)委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成并连接至pFastBacDual载体,命名为pFBD-SARS-CoV2-RBD-HF;sf9细胞由本实验室保存;DH10BacTM从赛默飞世尔科技(中国)有限公司购买。SARS-CoV-2RBD-HF基因序列:GGATCCAACTTAAAAAAAAAAATCAAAATGATCACCAACCTGTGCCCATTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACTAGGTTCGCCTCCGTCTACGCTTGGAACCGCAAG本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒,其特征在于,将新型冠状病毒受体结合域和铁蛋白的重组片段连接至载体,转化感受态细胞获得重组杆粒,转染至细胞收获重组杆状病毒。/n

【技术特征摘要】
1.表达新型冠状病毒RBD的重组铁蛋白纳米颗粒,其特征在于,将新型冠状病毒受体结合域和铁蛋白的重组片段连接至载体,转化感受态细胞获得重组杆粒,转染至细胞收获重组杆状病毒。


2.如权利要求1所述的重组铁蛋白纳米颗粒,其特征在于,所述载体为pFastBacDual载体;
所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞;
所述细胞为sf9细胞。


3.如权利要求1或2所述的重组铁蛋白纳米颗粒的制备方法,其特征在于,将新型冠状病毒受体结合域和铁蛋白的重组片段连接至载体,转化细胞获得重组杆粒,转染至细胞收获重组杆状病毒。


4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述载体为pFastBacDual载体;
所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞;
所述细胞为sf9细胞。


5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员:金宁一李昌郝鹏飞许汪李乐天陈竞鲁会军李霄田明尧高子函时小双郝嘉翼张爽伊立超宋利娜姜宇航徐鹏任世斌
申请(专利权)人:军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
类型:发明
国别省市:吉林;22

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