一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合蛋白，具体涉及一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白及应用。所述的基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中，第一多肽和第二多肽相互嵌合，第一多肽为EGF‑CTA2‑TAT蛋白，第二多肽包含霍乱毒素的CTB亚基序列和胃泌素多肽序列以及连接肽序列。该嵌合蛋白具有生物活性，并能大量、快速生产，能够用于通过口服灌胃的途径诱导胰腺再生，拓展了诱导胰腺再生的新型药物剂型。

【技术实现步骤摘要】
一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白及应用
本专利技术涉及一种嵌合蛋白，具体涉及一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白及应用。
技术介绍
糖尿病(DiabetesMellitus)是一种全球性疾病，分为1型糖尿病和2型糖尿病，近年的研究表明胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是2型糖尿病特征性的病理生理改变，二者相互作用，最终导致2型糖尿病的发生。不仅如此，胰岛素抵抗还参与了糖尿病慢性并发症如心血管并发症、糖尿病肾病等的发生、发展，是联系糖尿病、高血压、高脂血症、冠心病的一个重要枢纽。因此针对2型糖尿病的发病机制，采用有效的药物减轻胰岛素抵抗、增加胰岛素分泌对于2型糖尿病及其并发症的治疗具有重要的意义。现有2型糖尿病治疗药物主要包括双胍类药物、促胰岛素分泌药物以及胰岛素增敏剂，这类药物可单独使用或配合胰岛素联合进行治疗。不管是1型糖尿病还是2型糖尿病，都伴随着胰岛细胞的损伤，而目前使用的口服降糖药物无法解决胰岛β细胞凋亡的问题，并且在治疗时存在严重副反应。研究表明，表皮生长因子(EGF)联合胃泌素也能增加来自成人胰腺组织的胰岛中的β细胞质量。表皮生长因子联合胃泌素增加培养的人胰岛中β细胞的数量，这种作用在从培养基中去除胃泌素、表皮生长因子后可持续4周。胰岛细胞始终存在于人类胰岛中，β细胞数量的增加归因于表皮生长因子刺激导管细胞增殖和导管细胞PDX-1表达和分化中胃泌素依赖性增加介导的β细胞新生激活。在将人胰岛移植到糖尿病小鼠体内后，表皮生长因子联合胃泌素也增加了功能性的细胞数量。表皮生长因子联合胃泌素诱导胰腺导管细胞β细胞新生的能力对治疗1型和2型糖尿病的新方法具有潜在意义。霍乱毒素是由霍乱弧菌产生的肠毒素，由1个A单位(CTA)和5个B单位(CTB)形成的多聚体连接而成。CTA为毒性亚单位，CTB为无毒的受体结合亚单位，可以和所有有核细胞膜上的神经节苷脂(GM1)受体结合。CTB作为免疫佐剂，已用于重组B亚单位/菌体霍乱疫苗(上海联合赛尔生物工程有限公司)，使用剂量为每剂1mg，证明是安全的。CTB也可作为有效的蛋白药物呈递载体，Arati等人(AratiLimaye,VijayKoya,MohtashemSamsam,andHenryDaniell.Receptor-mediatedoraldeliveryofabioencapsulatedgreenfluorescentproteinexpressedintransgenicchloroplastsintothemousecirculatorysystem.FASEBJ.2006,May；20(7):959-961.)将CTB和绿色荧光蛋白GFP在烟草叶绿体中融合表达，用这种烟草喂食Balb/c小鼠，作者发现融合蛋白结合到了细胞膜表面的GM1受体上，GFP进入了淋巴循环，进一步进入血液循环系统。表皮生长因子联合胃泌素诱导胰腺再生注射剂型以及体外诱导细胞分化后移殖已在临床实验中应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白。本专利技术的另一目的在于提供上述基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，包含第一多肽和第二多肽，其中，第一多肽和第二多肽相互嵌合，第一多肽为EGF-CTA2-TAT蛋白，第二多肽包含霍乱毒素的CTB亚基序列和胃泌素(GAS)多肽序列以及连接肽序列；所述的第二多肽是具有如SEQIDNO.1所述的序列的霍乱毒素B亚基，或与该序列具有80％同源性的霍乱霉素B亚基类似物和如SEQIDNO.2所述的序列的胃泌素多肽，或与该序列具有80％同源性的胃泌素多肽类似物和如SEQIDNO.3所述的序列的连接肽；所述的连接肽通过细胞内的酶或环境因素而裂解；所述的第二多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；编码上述第二多肽的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述的第二多肽，通过如下方法制备得到：将末端包含弗林蛋白酶切位点RRRR序列的连接肽和末端包含弗林蛋白酶切位点RRRR序列的胃泌素GAS序列顺次连接并基因合成，得到Linker-GAS，将Linker-GAS酶切后插入到pET28a-CTB载体中，得到重组载体pET28a-CTB-Linker-GAS，再将该组载体pET28a-CTB-Linker-GAS导入宿主菌中进行蛋白表达并纯化，得到第二多肽((CTB-Linker-GAS)5蛋白)；所述宿主菌为大肠杆菌BL21、DH5α或Rosetta；所述的纯化优选为在亲和层析柱上复性进行纯化；所述的基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白的制备方法，优选包含如下步骤：(1)将第一多肽(EGF-CTA2-TAT蛋白)与第二多肽((CTB-Linker-GAS)5蛋白)在pH＝2.0～2.5、温度为23℃～25℃的条件下变性15min～30min；(2)变性后再在pH＝8.3～8.5、温度为4℃的条件下复性1h～48h，得到基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白；所述的第一多肽(EGF-CTA2-TAT蛋白)与第二多肽((CTB-Linker-GAS)5蛋白)的摩尔比为1：1；所述的变性的条件优选为在pH＝2.3、温度为23℃的条件下变性20min，所述的复性的条件优选为在pH＝8.5、温度为4℃的条件下复性1h；所述的变性的pH值优选采用0.5M柠檬酸调节；所述的复性的pH值优选采用2MTris调节；一种药物组合物，包含上述基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白和辅料；所述辅料包括肠溶胶囊、平衡盐、糖和氨基酸中的至少一种；所述的基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白或药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用；所述糖尿病为I型糖尿病或II性糖尿病；本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供了一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，该嵌合蛋白为EGF-CTA2-TAT/(CTB-Linker-GAS)5，由EGF-CTA2-TAT和(CTB-Linker-GAS)5嵌合组装而成；其中，肠道黏膜上有丰富的神经节苷脂GM1，霍乱毒素B亚基(CTB)能与其结合；霍乱毒素A2亚基(CTA2)能与CTB结合，且本身具有弱穿透细胞膜的能力；穿膜肽TAT能够跨膜导入细胞内，并保持细胞完好无损；表皮生长因子与胃泌素联合具有能诱导胰腺导管细胞转分化再生成胰岛β细胞的功能。(2)本专利技术(CTB-Linker-GAS)5融合蛋白能与EGF-CTA2-TAT通过酸碱相互嵌合，得到了嵌合蛋白EG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，其特征在于包含第一多肽和第二多肽，其中，第一多肽和第二多肽相互嵌合，第一多肽为EGF-CTA2-TAT蛋白，第二多肽包含霍乱毒素的CTB亚基序列和胃泌素多肽序列以及连接肽序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，其特征在于包含第一多肽和第二多肽，其中，第一多肽和第二多肽相互嵌合，第一多肽为EGF-CTA2-TAT蛋白，第二多肽包含霍乱毒素的CTB亚基序列和胃泌素多肽序列以及连接肽序列。


2.根据权利要求1所述的基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，其特征在于：
所述的第二多肽是具有如SEQIDNO.1所述的序列的霍乱毒素B亚基，或与该序列具有80％同源性的霍乱霉素B亚基类似物和如SEQIDNO.2所述的序列的胃泌素多肽，或与该序列具有80％同源性的胃泌素多肽类似物和如SEQIDNO.3所述的序列的连接肽。


3.根据权利要求2所述的基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，其特征在于：
所述的第二多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求3所述的基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，其特征在于：
编码第二多肽的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


5.根据权利要求4所述的基于霍乱毒素多聚体结构的诱导胰腺再生的口服嵌合蛋白，其特征在于：
所述的第二多肽，通过如下方法制备得到：
将末端包含弗林蛋白酶切位点RRRR序列的连接肽和末端包含弗林蛋白酶切位点RRRR序列的胃泌素GAS序列顺次连接并基因合成，得到Linker-GAS，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华倩，孙家杰，何华锋，何贤樱，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44