一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。所述融合蛋白包括融合表达的SARS‑CoV‑2病毒S蛋白的RBD区域和IgG抗体的Fc区域。本发明专利技术通过将SARS‑CoV‑2的棘突蛋白的RBD结构域与免疫球蛋白Fc进行融合表达获得重组融合蛋白，Fc的铰链区以及恒定区能通过二硫键将IgG抗体的两条重链相结合，实现RBD的二聚体，制备的重组融合蛋白可用于作为针对新型冠状病毒肺炎的重组蛋白疫苗。该重组蛋白疫苗可在小鼠体内诱导产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体，抗体水平可维持3个月以上，该疫苗能同时诱导小鼠产生细胞免疫。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用
本专利技术涉及疫苗
，特别是涉及一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。
技术介绍
冠状病毒属于尼多病毒目，冠状病毒科的一种具有包膜的单股正链的RNA病毒(+ssRNA)，又可分为α、β、γ、δ属。其中，α、β属主要感染哺乳动物，而γ、δ属主要感染禽类，少数情况下也感染哺乳动物。新型冠状病毒肺炎(COVID-19)则是由β属的SARS-CoV-2病毒所引起。SARS-CoV-2病毒其基因组编码四种结构蛋白，分别为棘突蛋白，包膜蛋白，膜蛋白以及核衣壳蛋白。其中，S蛋白的受体结合结构域(Receptorbindingdomain，RBD)通过结合宿主细胞膜上的血管紧张素转化酶2(ACE2)感染人体。在缺乏特效药的情况下，疫苗仍然是保护人群的最有效的防控手段。S蛋白在介导病毒感染的初期发挥重要作用，是产生中和抗体的主要区域。成熟的S蛋白是以三聚体形式构成病毒表面的“皇冠状”外形。S蛋白的膜远端S1结构域包括了RBD结构域，主要与宿主细胞膜上的ACE2受体结合。膜近端S2结构域包括了FP(Fusionpeptide，融合肽)成分。S蛋白三聚体在未结合受体之前，2个RBD结构域处于“向下”状态，1个RBD结构域处于“向上”状态。在与受体结合之后，蛋白酶体识别并切割弗林蛋白酶切位点，继而导致S1结构脱落，接着触发S2亚基构象的改变，S2的FP成分暴露有利于病毒包膜和宿主细胞膜的融合，最终实现病毒包膜和宿主细胞膜的融合。当宿主感染SARS-CoV-2之后，体内会产生多种结合S蛋白的中和抗体，大部分靶向RBD结构域，少部分靶向NTD结构域。由于RBD结构域相比全长S蛋白，S1结构域，S2结构域，诱导产生的中和抗体能力显著强于其他结构，之前关于MERS和SARS的RBD重组蛋白已证明其作为重组蛋白疫苗开发的理想的候选抗原。疫苗开发五大类型：减毒活疫苗、灭活疫苗、病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗。重组蛋白疫苗可细分为重组S蛋白疫苗、重组RBD疫苗和类病毒颗粒疫苗(VLPs)。这些重组蛋白可以通过不同的表达系统表达，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母、原核细胞以及植物。不同表达体系的差异体现在翻译后修饰。原核细胞不具有翻译后修饰的功能，因此丧失了对S蛋白或者RBD蛋白糖基化的修饰。但是，目前发现SARS-CoV-2的棘突蛋白表面存在许多糖基化修饰，也许这些糖基化修饰参与稳定RBD构，也可能作为是免疫原性的一部分。但是，有些糖基化修饰也可能掩蔽表位区域。因此，即便对于相同的重组蛋白疫苗，不同的表达体系也有可能导致其免疫原性的差异。一般来说，哺乳动物表达的RBD重组蛋白疫苗比昆虫和大肠杆菌中表达的RBD重组蛋白疫苗能够诱导更强的中和抗体反应。另一方面，重组蛋白疫苗通常仅包含中和表位产生的结构域，因此，这些疫苗大多数都含有全长S蛋白或者部分结构，比起S蛋白，RBD结构域可能缺乏了其他中和表位，比如靶向NTD区域。但是，全长S蛋白疫苗可能能够诱导不必要的免疫反应，导致抗体介导的疾病增强。RBD作为单体形式直接应用于疫苗，其免疫原性较弱。所以往往要结合适合的佐剂或者引入额外的蛋白形成二聚体以增加其免疫原性。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种免疫效果更好、由SARS-CoV-2的棘突蛋白的RBD结构域与免疫球蛋白Fc进行融合表达的重组融合蛋白，可用于作为针对新型冠状病毒肺炎的重组蛋白疫苗。一种融合蛋白，包括融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白的RBD区域和IgG抗体的Fc区域。优选的，RBD区域的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，该序列为棘突蛋白的330-583aa。优选的，IgG抗体为人源IgG抗体或鼠源IgG抗体。更优选的，人源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；鼠源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。优选的，RBD区域与Fc区域之间通过柔性连接接头进行连接，柔性连接接头的氨基酸序列为GGGGS。柔性连接接头的作用在于避免RBD结构域和Fc结构域可能出现的相互影响，当然除了Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)序列外，其中Gly与Ser的数量、位置等均可以再调整，或者使用其他常用的柔性连接接头，柔性连接接头本身对RBD结构域和Fc结构域的结构没有影响。本专利技术又提供了编码所述融合蛋白的基因。优选的，编码RBD区域的序列如SEQIDNo.4所示，编码Fc区域的序列如SEQIDNo.5或6所示。所述的基因，还包括位于编码RBD区域的序列上游的信号肽编码序列以及位于信号肽编码序列上游的Kozak序列，信号肽编码序列如SEQIDNo.7所示，Kozak序列为ACCACC。Kozak序列是位于真核生物mRNA5’端帽子结构后面的一段核酸序列，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始，用来增强真核基因的翻译效率的。信号肽用于在真核细胞表达系统中做分泌表达，一般使用HEK293细胞进行表达的话，使用HEK293细胞的信号肽，如果用其他细胞表达系统，就相应使用其他细胞对应的信号肽即可。本专利技术还提供了所述融合蛋白在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。一种新型冠状病毒亚单位疫苗，包含所述融合蛋白。本专利技术通过将SARS-CoV-2的棘突蛋白的RBD结构域与免疫球蛋白Fc进行融合表达获得重组融合蛋白，已知Fc的铰链区以及恒定区能通过二硫键将IgG抗体的两条重链相结合，因此，利用这一特性，将其应用于RBD二聚体蛋白的设计上，制备的重组融合蛋白可用于作为针对新型冠状病毒肺炎的重组蛋白疫苗。另外，Fc通过FcRn受体途径，可以将Fc融合药物从溶酶体的降解中拯救出来，从而有效延长药物的半衰期。本专利技术制备的重组蛋白疫苗可在小鼠体内诱导产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体，抗体水平可维持3个月以上，该疫苗能同时诱导小鼠产生细胞免疫。附图说明图1为连接鼠源Fc或者人源Fc的RBD重组蛋白疫苗示意图。图2为分子筛纯化RBD重组蛋白疫苗的结果，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc。图3为SDS-PAGE分析分子筛纯化后RBD重组蛋白疫苗的结果，其中，图A为RBD-hFc样品且为非还原性SDS-PAGE，图B为RBD-hFc样品且为还原性SDS-PAGE，图C为RBD-mFc样品且为非还原性SDS-PAGE，图D为RBD-mFc样品且为还原性SDS-PAGE，图E为S1-hFc样品且为还原性SDS-PAGE。图4为SEC-HPLC分析分子筛纯化后RBD重组蛋白疫苗的结果，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc。图5为VEROE6细胞检测RBD重组蛋白疫苗亲和力检测图，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc；图A和B中，左侧的峰为对照组，即一抗加入的PBS溶液。图6为RBD重组蛋白免疫后IgG滴度检测的结果。其中对照组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，包括融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白的RBD区域和IgG抗体的Fc区域。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，包括融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白的RBD区域和IgG抗体的Fc区域。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，RBD区域的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，IgG抗体为人源IgG抗体或鼠源IgG抗体。


4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，人源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；鼠源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。


5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，RBD区域与Fc区域之间通过柔性连接接头进行连接，柔性连接接头的氨基酸序列为GG...

【专利技术属性】
技术研发人员：周展，周晶晶，蒋健敏，朱函坪，孙一晟，姚萍萍，陈晨，赵文彬，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33