具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，该片段命名为P2454，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了一种枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽，该信号肽命名为SP2454，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还公开了含上述DNA片段和上述信号肽的重组载体或重组工程菌在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体，并成功应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现了高效生产。本发明专利技术提供的启动子特征揭示它在工业生产中具有重要应用价值。特征揭示它在工业生产中具有重要应用价值。特征揭示它在工业生产中具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域和分子生物学
，涉及一种DNA片段及其应用，具体说，涉及一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌是一种重要的原核表达宿主，其遗传背景清晰，遗传操作简单，具有较强的蛋白分泌能力，不具有致病性，发酵工艺成熟。广泛用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等工业用酶。
[0003]启动子是直接影响基因表达水平的重要的基因组调控元件，在细菌中，RNA聚合酶和相关的sigma因子识别启动子，并通过调节蛋白与启动子内特定位点的结合而被招募。迄今为止，已有三种启动子用于枯草杆菌异源蛋白的高水平表达：组成性启动子、诱导特异性启动子和自诱导启动子。组成型启动子，如P43启动子，会影响菌体生长，不适合生产对宿主有毒的物质。诱导型启动子(如Pspac和Pxyl)是使用最广泛的类型，但是诱导物如IPTG和木糖一般价格昂贵，会增加工业生产成本。自诱导启动子是大规模蛋白质生产的理想选择。这样的启动子可以诱导目标基因从对数晚期到稳定期的表达，而不需要诱导物，这有助于以较低的成本高效生产异源蛋白，然而，低活性是该类启动子目前广泛应用的一个障碍。因此有必要找到更高效、适合于工业培养基生产表达的启动子。除启动子外，核糖体结合位点(RBS)、SD序列和信号肽等元件也会影响蛋白的表达。通常根据转录组测序结果，可以筛选到转录水平较高的启动子，然而进行蛋白表达时还需要对上述元件进行进一步的优化。
[0004]果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层的杂多糖，根据果胶分子主链和支链结构的不同,可以将其分为3类:同型半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan,HG)，鼠李半乳糖醛酸聚糖I(Rhamngalacturonan I,RGI)，鼠李半乳糖醛酸聚糖II(Rhamngalacturonan II,RGII)。该酶作用于果胶可以释放不同聚合度的寡糖，这些寡糖具有益生作用(In
ê
s R Silva,Jers C,Otten H,et al.Design of thermostable rhamnogalacturonanlyase mutants from Bacillus licheniformis by combination of targeted single point mutations[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(10):4521)但检索发现，利用在枯草芽孢杆菌胞外蛋白质组信息，克隆胞外含量较高蛋白的启动子和信号肽编码区的DNA片段并使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现高效生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的文献或专利还未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。
[0006]本专利技术所述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，其特征在于：该DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列为如下任一序列：
[0007](1)如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
[0008](2)与序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；
[0009](3)对上述(1)或(2)所示DNA序列进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有相同启动子功能的DNA序列。
[0010]上述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，优选的实施方式是：所述DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
[0011]本专利技术还提供了一种枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽，其特征在于：所述信号肽命名为信号肽SP2454，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0012]编码上述枯草芽孢杆菌信号肽的基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0013]本专利技术还提供了一种重组载体，其特征在于：所述重组载体命名为pN
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P2454
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SP2454，是将上述启动子P2454核苷酸序列与上述编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接到载体pNW33N上获得；其中所述编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接在启动子P2454下游，在P254介导下表达。
[0014]本专利技术还提供了一种鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶分泌表达载体，其特征在于：所述分泌表达载体命名为pN
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rgl，是将编码鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的基因rgl连接到重组载体pN
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P2454
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SP2454的SP 2454编码基因下游得到；其中所述编码鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0015]本专利技术还提供了一种产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的重组工程菌，其特征在于：是利用鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶分泌表达载体pN
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rgl转化宿主细胞得到。
[0016]上述的重组工程菌中：所述宿主细胞优选草芽孢杆菌7
‑3‑
3，所述表达载体pN
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rgl转化宿主细胞得到的重组工程菌命名为BS
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OErgl。
[0017]含上述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段和上述枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽的重组载体或重组工程菌在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。
[0018]申请人通过对一株在麸皮玉米粉组成廉价培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌的发酵液上清进行了蛋白质组分析，筛选到了一个在发酵液中含量较高的蛋白，克隆了其启动子和信号肽编码序列。使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体，并成功应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现了高效生产。该启动子特征揭示它在工业生产中的应用具有重要价值。本专利技术的突出效果体现在：在当前枯草芽孢杆菌缺少可工业化应用的启动子背景下，本专利技术提供的具有启动子和信号肽功能的DNA片段，不需要添加诱导物的条件下即能实现蛋白基因的分泌表达，将其运用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的表达，为枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白提供了有效的手段，具有很好的开发前景。
附图说明
[0019]图1.含有启动子和信号肽编码序列的DNA片段PCR扩增产物的电泳图，其中：M为DNA分子量Marker，泳道1为DNA片段。
[0020]图2.重组载体pN
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P2454
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SP2454构建示意图。
[0021]图3.重组载体pN
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rgl构建示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列为如下任一序列：(1)如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；(2)与序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；(3)对上述(1)或(2)所示DNA序列进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有相同启动子功能的DNA序列。2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。3.一种枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽，其特征在于：所述信号肽命名为信号肽SP2454，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。4.一种编码权利要求3所述枯草芽孢杆菌信号肽的基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。5.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体命名为pN
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P2454
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SP2454，是将权利要求1所述启动子P2454核苷酸序列与权利要求4所述编码信号肽SP2454的基因核苷酸序列连接到载体pNW33N上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪芝，王金城，赵建，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：