针对α-突触核蛋白的变体RNAi制造技术

本文提供了治疗神经变性突触核蛋白病的RNAi分子。在一些实施方案中，所述RNAi分子靶向α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对
α
‑
突触核蛋白的变体RNAi
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年8月3日提交的美国临时申请号62/714,616的优先权权益，将其通过引用以其全文特此并入。
[0003]ASCII文本文件序列表的提交
[0004]将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其全文并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：159792016540SEQLIST.TXT，记录日期：2019年7月31日，大小：19KB)。


[0005]本公开文本涉及变体RNAi分子。在一些方面，本公开文本涉及针对α
‑
突触核蛋白的变体RNAi。

技术介绍

[0006]长期神经保护疗法对于治疗神经变性突触核蛋白病如帕金森病或多系统萎缩症(MSA)具有相当大的意义。RNA干扰(RNAi)是通过引入与靶标互补的RNA(siRNA)来减少靶mRNA的机制。还可以将所述siRNA序列插入人工miRNA支架(“shmiRNA”)中，这允许基于聚合酶II的组成型表达，同时还消除与脑中siRNA或shRNA的引入相关的神经毒性(1)。
[0007]临床开发RNAi的阻碍是脱靶沉默的可能性，其中RNAi的种子区(通常是核苷酸1
‑
7或1
‑
8)与3
’
非翻译区(UTR)中非靶mRNA中的序列配对，导致转录物不稳定。减少脱靶沉默的尝试包括使用算法鉴定具有针对靶mRNA的高特异性且具有最小脱靶可能的候选种子序列(Boudreau RL等人,(2012)Nucl.Acids Res.41(1):e9)，以及将内部凸起放置在RNAi的指导区域中(Terasawa等人,(2011)Journal of nucleic acids 2011:131579)。
[0008]多个证据证实，α
‑
突触核蛋白(SNCA)水平的升高具有神经毒性，而降低具有神经保护作用(2
‑
9)。因此，降低SNCA水平的治疗策略可能潜在地阻止神经变性疾病的进展并减轻症状。仍然需要利用RNAi机制的这种治疗策略。
[0009]本申请通过提供针对SNCA的变体RNAi分子以及使用其治疗和预防神经变性疾病的方法满足了这种需要。本申请还提供了筛选或鉴定针对SNCA的RNAi分子的方法和用于制备这些RNAi分子的构建体。

技术实现思路

[0010]在一些方面，本专利技术提供了包含第一链和第二链的RNAi，其中a)第一链和第二链形成双链体；b)第一链包含指导区，其中所述指导区包含与序列5
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(SEQ ID NO:24)具有至少约90％同一性或与序列5
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UGGGCACAUUGGAACUGAGCA
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(SEQ ID NO:8)具有至少约90％同一性的核酸；以及c)第二链包括非指导区。在一些实施方案中，所述指导区包含核酸序列5
’‑
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(SEQ ID NO:24)，而所述非指导区包含序列5
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(SEQ ID NO:
53)。在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:24具有约90％同一性或与SEQ ID NO:53具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述指导区包含核酸序列5
’‑
UGGGCACAUUGGAACUGAGCA
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(SEQ ID NO:8)，而所述非指导区包含序列5
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(SEQ ID NO:37)。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:37具有约90％同一性或与SEQ ID NO:37具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，第一链与第二链借助能够形成环结构的RNA接头连接。在一些实施方案中，所述RNA接头包含4至50个核苷酸。在一些实施方案中，所述环结构包含4至20个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNAi从5
’
到3
’
包含所述第二链、所述RNA接头和所述第一链。在一些实施方案中，所述RNAi从5
’
到3
’
包含所述第一链、所述RNA接头和所述第二链。在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
[0011]在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述RNAi靶向对与神经变性突触核蛋白病相关的多肽进行编码的RNA。在一些实施方案中，所述多肽是α
‑
突触核蛋白(SNCA)。在一些实施方案中，所述α突触核蛋白是人α
‑
突触核蛋白。在一些实施方案中，所述神经变性突触核蛋白病是帕金森病(PD)、多系统萎缩症(MSA)、或路易体痴呆(DLB)。
[0012]在以上方面和实施方案的一些实施方案中，本专利技术提供了包含编码本文所述的RNAi的核酸的表达构建体。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶
‑
1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素应答性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β
‑
肌动蛋白/兔β
‑
球蛋白启动子(CAG)启动子、延长因子1
‑
α启动子(EFl
‑
α)启动子、人β
‑
葡糖醛酸酶启动子、鸡β
‑
肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13
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肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述表达构建体还包含内含子。在一些实施方案中，所述内含子是CBA内含子或hEF1α内含子。在一些实施方案中，所述内含子是嵌合内含子。在一些实施方案中，所述表达载体是自身互补的载体，且所述内含子是δ嵌合内含子。在一些实施方案中，所述表达构建体还包含多腺苷酸化信号。在一些实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种RNAi，其包含第一链和第二链，其中a)所述第一链与所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含与序列5
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(SEQ ID NO:24)具有至少约90％同一性或与序列5
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(SEQ ID NO:8)具有至少约90％同一性的核酸；并且c)所述第二链包含非指导区。2.根据权利要求1的RNAi，其中所述指导区包含核酸序列5
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(SEQ ID NO:24)，而所述非指导区包含序列5
’‑
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(SEQ ID NO:53)。3.根据权利要求1的RNAi，其中所述第一链包含与SEQ ID NO:24具有约90％同一性或与SEQ ID NO:53具有约90％同一性的核酸序列。4.根据权利要求1的RNAi，其中所述指导区包含核酸序列5
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UGGGCACAUUGGAACUGAGCA
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(SEQ ID NO:8)，而所述非指导区包含序列5
’‑
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(SEQ ID NO:37)。5.根据权利要求1的RNAi，其中所述第二链包含与SEQ ID NO:37具有约90％同一性或与SEQ ID NO:37具有约90％同一性的核酸序列。6.根据权利要求1
‑
5中任一项的RNAi，其中所述第一链与所述第二链借助能够形成环结构的RNA接头连接。7.根据权利要求6的RNAi，其中所述RNA接头包含4至50个核苷酸。8.根据权利要求6或7的RNAi，其中所述环结构包含4至20个核苷酸。9.根据权利要求6
‑
8中任一项的RNAi，其中所述RNAi从5
’
到3
’
包含所述第二链、所述RNA接头和所述第一链。10.根据权利要求6
‑
8中任一项的RNAi，其中所述RNAi从5
’
到3
’
包含所述第一链、所述RNA接头和所述第二链。11.根据权利要求10的RNAi，其中所述RNAi包含SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63的核酸序列。12.根据权利要求11的RNAi，其中所述RNAi包含与SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:63的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。13.根据权利要求1
‑
12中任一项的RNAi，其中所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。14.根据权利要求1
‑
13中任一项的RNAi，其中所述RNAi靶向对与神经变性突触核蛋白病相关的多肽进行编码的RNA。15.根据权利要求14的RNAi，其中所述多肽是α
‑
突触核蛋白(SNCA)。16.根据权利要求15的RNAi，其中所述α突触核蛋白是人α
‑
突触核蛋白。17.根据权利要求14
‑
16中任一项的RNAi，其中所述神经变性突触核蛋白病是帕金森病(PD)、多系统萎缩症(MSA)、或路易体痴呆(DLB)。18.一种表达构建体，其包含编码权利要求1至17中任一项的RNAi的核酸。19.根据权利要求18的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。20.根据权利要求18或19的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸可操作地连接至启
动子。21.根据权利要求20的表达构建体，其中所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶
‑
1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素应答性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β
‑
肌动蛋白/兔β
‑
球蛋白启动子(CAG)启动子、延长因子1
‑
α启动子(EFl
‑
α)启动子、人β
‑
葡糖醛酸酶启动子、鸡β
‑
肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13
‑
肌动蛋白启动子。22.根据权利要求18
‑
21中任一项的表达构建体，其中所述表达构建体还包含内含子。23.根据权利要求22的表达构建体，其中所述内含子是CBA内含子或hEF1α内含子。24.根据权利要求22的表达构建体，其中所述内含子是嵌合内含子。25.根据权利要求22的表达构建体，其中所述表达载体是自身互补的载体，且所述内含子是δ嵌合内含子。26.根据权利要求18
‑
25中任一项的表达构建体，其中所述表达构建体还包含多腺苷酸化信号。27.根据权利要求26的表达构建体，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号或HSV TK多腺苷酸化信号。28.一种载体，其包含根据权利要求18
‑
27中任一项的表达构建体。29.根据权利要求28的载体，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。30.根据权利要求29的rAAV载体，其中所述表达构建体侧翼是一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。31.根据权利要求30的rAAV载体，其中所述表达构建体的侧翼是两个AAVITR。32.根据权利要求30或31的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。33.根据权利要求30
‑
32中任一项的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。34.根据权利要求30
‑
33中任一项的rAAV载体，其中所述载体还包含填充核酸。35.根据权利要求34的rAAV载体，其中所述填充核酸位于编码所述RNAi的核酸的上游或下游。36.根据权利要求30
‑
35中任一项的rAAV载体，其中所述载体是自身互补的rAAV载体。37.根据权利要求36的rAAV载体，其中所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿着其大部分或所有长度形成链内碱基对。38.根据权利要求37的rAAV载体，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失并且包含末端解析序列的突变。39.一种细胞，其包含根据权利要求29
‑
38中任一项的rAAV载体。40.一种重组AAV粒子，其包含根据权利要求29
‑
38中任一项的rAAV载体。41.根据权利要求40的rAAV粒子，其中所述AAV病毒粒子包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、
ID NO:24)具有至少约90％同一性的第一核酸的第一链以及含有与序列5
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GGCUGAGAACCAAAGAGUA
‑3’
(SEQ ID NO:53)具有至少约90％同一性的第二核酸的第二链，或含...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：