一种创制高抗稳定的内源抗除草剂水稻的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过植物碱基编辑技术创制新抗除草剂水稻的方法。利用本发明专利技术提供的水稻乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因的特定靶点序列，使用单碱基编辑载体对水稻ACCase的编码基因特定靶点进行定点替换，获得了一种由野生型ACCase的编码基因核苷酸序列中的第6113位核苷酸G被核苷酸C取代的ACCase基因突变型，其相应编码的氨基酸序列的第2038位的色氨酸突变为丝氨酸，从而获得ACCase突变型蛋白。含有该种蛋白的水稻具有甲禾灵类除草剂抗性。本发明专利技术制备得到的甲禾灵类除草剂抗性水稻可耐受80mg/ml的甲禾灵除草剂喷施处理，具有很高的育种和栽培价值。育种和栽培价值。育种和栽培价值。

【技术实现步骤摘要】
一种创制高抗稳定的内源抗除草剂水稻的方法


[0001]本专利技术涉及植物生物
具体而言，本专利技术涉及一种通过植物碱基编辑技术创制新抗除草剂植物的方法。

技术介绍

[0002]田间杂草与作物竞争水、肥、光及生长空间，直接影响农作物产量与质量。同时许多杂草又是作物病原菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。当前，市场上广泛应用的选择性除草剂施用量大，残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。甲禾灵等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点。但它们除草没有选择性，不能直接用在作物的生长期。通过基因工程技术和遗传转化方法培育耐该类灭生性除草剂的水稻可以直接有效的解决这个问题。因此，耐除草剂水稻具有非常广阔的应用价值和市场潜力。
[0003]基因组编辑系统CRISPR-Cas9已成为医学研究中的一种非常重要的工具，并且最终可能在农业、生物能源和食品安全等领域产生重大影响。CRISPR-Cas9可通过短的RNA片段(即向导RNA,gRNA)引导到基因组上的不同位点，然后利用一种称为Cas9的DNA切割酶随后再改位点进行所需的编辑。
[0004]利用化学诱变、辐射诱变等方法产生抗除草剂抗性植株的概率低成本高，有可能产生连锁的不良突变。有必要使用更简单高效的方法去获得除草剂抗性植物。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以赋予水稻内源性除草剂抗性的突变型的方法。进一步地，本专利技术方法可以定位植物抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性的水稻ACCase突变型。经实验证实，含有所述ACCase突变型的水稻对甲禾灵除草剂具有较好的耐受性。
[0006]具体而言，本专利技术提供一种创制高抗稳定的内源抗除草剂水稻方法，其特征在于，包括将用于对水稻植物基因组中的除草剂抗性相关基因进行碱基编辑的系统导入植物，所述系统包含以下两项中至少一项：
[0007]i)碱基编辑融合蛋白，和向导RNA；
[0008]ii)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列、编码向导RNA的核苷酸序列的表达盒；
[0009]其中，所述向导RNA将所述碱基编辑融合蛋白靶向所述水稻中的除草剂抗性相关基因的靶序列，导致所述序列中的一个核苷酸被取代，
[0010]其中，所述碱基编辑融合蛋白包含核酸酶失活的CRISPR核酸酶结构域和脱氨酶结构域，所述向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向至水稻基因组中的除草剂抗性相关基因的靶序列，致使所述除草剂抗性相关基因中一个核苷酸被取代进而赋予水稻除草剂抗性。
[0011]优选地，其步骤如下：
[0012]a)构建含有除草剂抗性相关基因靶标序列的sgRNA和碱基编辑融合蛋白的单碱基编辑系统的表达载体和表达盒；
[0013]b)将上述表达载体导入水稻愈伤组织，在导入愈伤组织的过程中，使用潮霉素和除草剂作为筛选剂筛选抗性愈伤组织，抗性愈伤经过分化和生根阶段，长出抗性水稻植株。
[0014]c)对获得的抗性植株，进行目的基因分子检测，检测除草剂抗性相关基因靶标序列的突变类型。
[0015]优选地，核酸酶失活的CRISPR核酸酶包括核酸酶失活的Cas9，所述除草剂是甲禾灵类和盖草能中的一种或多种。
[0016]优选地，碱基编辑系统导入植物的方法包括：基因枪法、PEG介导的原生质体转化、农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法，优选的，选用农杆菌介导的转化方法。
[0017]优选地，水稻中的除草剂抗性相关基因为乙酰辅酶A羧化酶ACCase的编码基因，其序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
[0018]优选地，水稻基因组中ACCase基因的靶序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1中的第6093位至6113位所示，为ctgttcatcctcgctaactg，所述ACCase基因中的第6113位核苷酸G被核苷酸C取代，ACCase突变体的基因序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
[0019]优选地，所述ACCase突变体基因翻译的突变体蛋白的氨基酸序列，第2038位由野生型序列中的色氨酸突变为丝氨酸，使其具有乙酰辅酶A羧化酶活性，ACCase突变蛋白序列，氨基酸位置如序列表中SEQ ID No.3所示。
[0020]优选地，还包括采用转基因、杂交或回交的方式将ACCase突变型基因导入受体植物中，使其具有对除草剂的抗性。
[0021]另一方面，本专利技术提供一种采用所述方法获得的突变基因或突变蛋白，其序列如序列表中SEQ ID No.2或3所示。
[0022]本专利技术的ACCase突变型基因突变发生的核苷酸包括但不仅限于上述突变，在以上位点突变成其他核苷酸的情况也在本专利技术的保护范围之内，例如：A突变为T、C、G；或T突变为T、C、G；或C突变为A、T、G；或G突变为T、C、A等等均在本专利技术的保护范围之内。
[0023]在上述位点突变成其他氨基酸的情况也在本专利技术的保护范围之内，例如：第2038位氨基酸由色氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸；
[0024]本专利技术还提供所述水稻ACCase突变型蛋白、核酸、基因，表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。
[0025]另外，所述获的具有除草剂抗性的植物的方法包括遗传转化、杂交、或回交。
[0026]此外，本专利技术的野生型基因来源于水稻的日本晴。
[0027]进一步地，本专利技术的日本晴的野生型植株不具有甲禾灵除草剂抗性，本专利技术含有ACCase突变位点的植株能赋予水稻增加对乙酰辅酶A羧化酶类除草剂的耐受性。
[0028]本专利技术所述的增强植物组织、植物细胞对除草剂的抗性方法可以通过转化或者杂交、自交和无性繁殖的方法实施，也可通过基因定点突变的方式获得，使改变的植株包括本专利技术的核苷酸序列SEQ ID No:2一种或多种。
[0029]技术效果
[0030]1、本专利技术采用的是单碱基编辑系统，对ACCase基因的特定靶点进行定点(优选，6093位-6113位)替换，通过将该系统导入受体后，通过除草剂抗性筛选，获得具有除草剂抗性的水稻植株。本专利技术具有操作简单、筛选过程简单的特点，发掘了水稻内源抗除草剂基因，增加除草剂基因的种类。
附图说明
[0031]图1为具有除草剂抗性的日本晴水稻的ACCase基因的6113位发生突变的测序结果图。
[0032]图2为在50mg/L潮霉素和9μmol的甲禾灵的筛选培养基(A)和分化培养基(B)上，具有甲禾灵抗性的愈伤能正常生长，并分化成水稻苗，不含甲禾灵抗性的愈伤组织死亡。
[0033]图3为对3-4叶幼苗期的抗除草剂水稻和野生型水稻喷施80mg/ml的甲禾灵除草剂后，植株仍然正常生长发育，而野生型水稻表现为喷施5天后整株死亡。
具体实施方式
[0034]下面结合实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
ID No.2或3所示。10.一种采用权利要求2中所述方法获得的突变基因或突变蛋白的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦瑞英，许蓉芳，刘小双，李娟，廖圣祥，魏鹏程，李浩，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：