脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修复制造技术

本发明专利技术涉及脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV

【技术实现步骤摘要】
脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修复


[0001]本专利技术属于生物医药领域，更具体地，本专利技术涉及脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修复。

技术介绍

[0002]心血管疾病是全世界危害最大的疾病之一，是导致人类疾病死亡的首要原因，尤其是动脉粥样硬化引起的心肌梗死和脑卒中已成为中国人最主要的死亡原因。家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，FH)是一种有家族性特征的常染色体显性遗传疾病，发生率约为1/200-1/500，患者主要临床表现为血浆中低密度脂蛋白胆固醇数值(LDL-C)异常超高，使得胆固醇沉积在皮肤、肌腱和冠状动脉等位置，而引起黄斑瘤、黄色瘤和动脉粥样硬化，给患者带来生命威胁。家族性高胆固醇血症通常由LDLR、APOB和PCSK9三个基因中的一个发生致病变异引起的，其中最主要由LDLR基因突变所致。该疾病包含两种临床亚型，纯合型家族性高胆固醇血症患者在10岁左右甚至更小就出现冠心病的症状和体征，多在30岁前死于心血管疾病，而杂合型家族性高胆固醇血症患者多在30～40岁患冠心病，即使只是一个有缺陷的基因拷贝，也使患者更易受到高胆固醇水平影响，最终得心血管疾病。该病的临床治疗包括药物治疗(最大耐受剂量的他汀类药物、于依折麦布、盂胆汁酸螯合剂、米泊美生和洛美他派等)、血浆清除治疗和肝移植，但是这些治疗方法存在药物时效性和不良反应、费用昂贵、肝供体不足及排斥反应等现象。
[0003]CRISPR/Cas9系统，原本是存在于细菌和古细菌中的一种免疫机制，现已被成功地人工改造使其成为第三代人工核酸内切酶，由于其成本低、系统简单及突变效率高等特点，被认为是一种具有良好应用前景的基因组定点改造工具。但是，CRISPR/Cas9系统也存在诸多缺陷，包括：其质粒仍然较大，转染难度较大；该系统具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且不同基因位点编辑效率不同。此外，CRISPR/Cas9存在的脱靶效应也是本领域的难题，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，造成研究结果的不确定性。上述的CRISPR/Cas9的技术缺陷，不仅对于CRISPR/Cas9系统的正确设计及应用提出了难题，同时也限制了其在临床药物研究中的广泛应用，目前临床上鲜少以基于CRISPR/Cas9的药物。
[0004]人类体内已命名基因有25000多个，目前已发现大约3000个基因的突变会引起各种遗传性疾病。但是，尽管有相当数量的基因与疾病的相关性已经被人们了解，但是却仍然鲜少靶向性治疗药物被成功开发，有一些仅在理论研究阶段。目前，利用CRISPR/Cas9成功建立动物模型也因脱靶等问题的存在而难以成功制备或稳定性差的问题。
[0005]综上，本领域尚没有开发出基于基因编辑技术且以脂代谢紊乱相关蛋白作为靶点的药物。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修
复。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供一种制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的方法，包括：针对啮齿类动物基因组中编码低密度脂蛋白受体第208位(其序列编号相应于或基于鼠源低密度脂蛋白受体)的密码子，利用CRISPR/Cas系统引入终止子；所述CRISPR/Cas系统包括：sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和含有突变位点的外源模板链序列。
[0008]在一个优选例中，所述的含有突变位点的外源模板链序列将低密度脂蛋白受体第208位突变为终止子，其具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
[0009]在另一优选例中，通过显微注射啮齿类动物受精卵来引入CRISPR/Cas系统，进而引入终止子。
[0010]在另一优选例中，在啮齿类动物生长后，进行高脂饮食诱导，获得脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型。
[0011]在另一优选例中，所述的高脂饮食为食物中含有高于20％(如20～25％；w/w)的脂肪和高于0.2％(如0.20～0.25％；w/w)的胆固醇。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的试剂盒，其中包括：CRISPR/Cas系统，包括sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和含有突变位点的外源模板链序列。
[0013]在一个优选例中，所述的含有突变位点的外源模板链具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
[0014]在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：高脂饮食，所述高脂饮食为食物中含有高于20％(如20～25％；w/w)的脂肪和高于0.2％(如0.20～0.25％；w/w)的胆固醇。
[0015]在本专利技术的另一方面，提供所述的方法或所述的试剂盒在制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型中的应用。
[0016]在本专利技术的另一方面，提供利用所述的方法或所述的试剂盒获得的脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的应用(较佳地，为非诊断或治疗性的应用)，用于：作为筛选缓解或治疗脂代谢紊乱疾病的候选药物或治疗剂的动物模型；或用于作为研究脂代谢紊乱疾病的动物模型；或用于作为研究脂代谢紊乱疾病的药物的动物模型。
[0017]在本专利技术的另一方面，提供一种靶向性修复低密度脂蛋白受体的方法，包括：以腺相关病毒递送Cas酶编码基因以及针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA至细胞内，从而靶向性修复低密度脂蛋白受体；所述腺相关病毒携带一供体序列，该供体序列来自低密度脂蛋白受体基因且包含编码野生型低密度脂蛋白受体第208位(其序列编号相应于或基于鼠源低密度脂蛋白受体，对于人的低密度脂蛋白受体同源序列而言为第207位)的密码子。
[0018]在一个优选例中，Cas酶的表达盒被置于腺相关病毒载体1中，sgRNA和供体序列片段的表达盒被置于腺相关病毒载体2中，分别包装为腺相关病毒1和腺相关病毒2；其中，所述Cas酶的表达盒中，包含TBG启动子，核定位信号序列，Cas酶编码核酸序列，末端反向重复序列；所述sgRNA和供体序列片段的表达盒中，包含U6启动子，sgRNA，供体序列，末端反向重复序列；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0019]在另一优选例中，以腺相关病毒感染细胞时，腺相关病毒1和腺相关病毒2按照滴度的比例为1:(7～15)；较佳地为1:(8～12)；更佳地为1:10。
[0020]在另一优选例中，所述靶向性修复低密度脂蛋白受体的方法为不以治疗为目的的
方法。
[0021]在本专利技术的另一方面，提供一种试剂盒，其中包括腺相关病毒载体或由该载体包装而成的腺相关病毒，所述腺相关载体包含：Cas酶编码基因；针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；供体序列，该供体序列来自低密度脂蛋白受体基因且包含编码野生型低密度脂蛋白受体第208位的密码子。
[0022]在一个优选例中，所述的供体序列长本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的方法，包括：针对啮齿类动物基因组中编码低密度脂蛋白受体第208位的密码子，利用CRISPR/Cas系统引入终止子；所述CRISPR/Cas系统包括：sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和含有突变位点的外源模板链序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有突变位点的外源模板链序列将低密度脂蛋白受体第208位突变为终止子，其具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在啮齿类动物生长后，进行高脂饮食诱导，获得脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型。4.一种用于制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的试剂盒，其中包括：CRISPR/Cas系统，包括sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和含有突变位点的外源模板链序列。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的含有突变位点的外源模板链具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：高脂饮食，所述高脂饮食为食物中含有高于20％的脂肪和高于0.2％的胆固醇。7.权利要求1～3任一所述的方法或权利要求4～6任一所述的试剂盒在制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型中的应用。8.利用权利要求1～3任一所述的方法或权利要求4～6任一所述的试剂盒获得的脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的应用，用于：作为筛选缓解或治疗脂代谢紊乱疾病的候选药物或治疗剂的动物模型；或用于作为研究脂代谢紊乱疾病的动物模型；或用于作为研究脂代谢紊乱疾病的药物的动物模型。9.一种靶向性修复低密度脂蛋白受体的方法，包括：以腺相关病毒递送Cas酶编码基因以及针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA至细胞内，从而靶向性修复低密度脂蛋白受体；所述腺相关病毒携带一供体序列，该供体序列来自低密度脂蛋白受体基因且包含编码野生型低密度脂蛋白受体第208位的密码子。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，Cas酶的表达盒被置于腺相关病毒载体1中，sgRNA和供体序列片段的表达盒被置于腺相关病毒载体2中，分别包装为腺相关病毒1和腺相关病毒2；其中，所述Cas酶的表达盒中，包含TBG启动子，核定位信号序列，Cas酶编码核酸序列，末端反向重复序列；...

【专利技术属性】
技术研发人员：周斌，赵欢，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：