一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP、其培养方法及应用技术

本发明专利技术实施例公开了一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP、其培养方法及应用，本发明专利技术实施例通过大剂量间歇冲击联合浓度梯度递增法诱导建立人胃癌DDP耐药细胞系，通过miRNA高通量测序筛选差异miRNA，公共数据库筛选出在人胃癌中与总体生存有显著相关性第一生物标记物miRNA，通过RT‑qPCR验证人胃癌细胞和血清标本，筛选出区分人胃癌DDP耐药患者和人胃癌DDP敏感患者的第二生物标志物miRNA，再通过分析患者临床参数与miRNA表达水平的关系并应用受试者工作特征(ROC)曲线评价其诊断效能，从而筛选最合适的目的miRNA，从而为病人就医提供更便利的条件。

【技术实现步骤摘要】
一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP、其培养方法及应用
本申请实施例涉及细胞工程
，具体涉及一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP、其培养方法及应用。
技术介绍
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，出现转移或周围侵犯的进展期胃癌首选以化疗为主的综合治疗，DDP是胃癌化疗中广泛应用的一线化疗药物，但胃癌细胞耐药是胃癌患者有效治疗的主要障碍，然而胃癌DDP耐药机制尚不清楚。建立稳定可靠的肿瘤耐药细胞系是体外研究肿瘤细胞产生的耐药机制的基础和前提，可为深入研究肿瘤耐药性发生的原因和机制，以及寻找预防和逆转肿瘤耐药的策略提供实验基础，经检索，未见与本申请的相同报道。微小RNA(miRNA)的异常表达与多种肿瘤的化疗敏感性有关，可用于预测化疗疗效，深入发掘胃癌发病机制相关的生物标志物miRNA，对于指导胃癌评估预后和诊疗具有很重要的意义，经检索，未见与本申请的相同报道。
技术实现思路
本专利技术实施例的一个目的在于提供一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP、其培养方法及应用，用于解决现有技术中无法深入研究肿瘤耐药性发生的原因和机制的技术问题。本专利技术实施例的另外一个目的在于提供一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的应用，用于解决现有技术中在胃癌治疗前无法有效评估含顺铂化疗方案的预期疗效及其生存期的技术问题。为了实现本专利技术的目的，本专利技术所采用的技术方案为：第一方面，本专利技术实施例提供了一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：a)对人胃癌细胞系MGC803进行DDP浓度大剂量间歇冲击性诱导，直到在含DDP第一浓度的DMEM培养基中稳定生长，建立人胃癌DDP中度耐药细胞系MGC803/DDP；b)通过DDP浓度梯度递增诱导法对所述人胃癌DDP中度耐药细胞系MGC803/DDP持续诱导，直到在含DDP第二浓度的DMEM培养基中维持生长并稳定传代，建立人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP，其中，所述第二浓度大于所述第一浓度。作为本专利技术第一方面的一个优选实施例，所述步骤b)具体包括以下步骤：b1)向中度耐药细胞系MGC803/DDP处于对数生长期细胞中加入含梯度浓度DDP的DMEM培养基，继续培养48h；b2)弃除含DDP的DMEM培养基，换用含维持浓度DDP的DMEM培养基进行培养，并每天更换新鲜含维持浓度DDP的DMEM培养基，直到传代后待细胞生长状态良好，存活细胞恢复生长并进入对数生长期再加入诱导浓度顺铂的DMEM完全培养基；重复上述步骤b1)-b2)，直到在含DDP第二浓度的DMEM培养基中维持生长并稳定传代，建立人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP。作为本专利技术第一方面的一个优选实施例，所述步骤b1)中含梯度浓度DDP的DMEM培养基以含2.5μg/mlDDP浓度的DMEM培养基为起始，每次递增0.5μg/mlDDP浓度。作为本专利技术的第一方面的一个优选实施例，所述步骤b2)中所述对进入对数生长期再加入诱导浓度DDP的DMEM完全培养基的诱导浓度DDP根据存活细胞增殖情况变化而进行设置。作为本专利技术第一方面的一个优选实施例，所述步骤b2)中含维持浓度DDP的DMEM培养基为含1μg/mlDDP浓度的DMEM培养基。作为本专利技术第一方面的一个优选实施例，所述含DDP第一浓度的DMEM培养基为含2.5μg/ml的DMEM培养基，所述含DDP第二浓度的DMEM培养基为含5μg/ml的DMEM培养基。作为本专利技术第一方面的一个优选实施例，所述人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP在含2μg/mlDDP浓度的DMEM培养基中维持其耐药性，在用于实验前一周撤去含DDP的DMEM培养基，并且在细胞传代一次稳定生长后使用。与现有技术相比，本专利技术实施例第一方面提供的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法并通过此培养方法建立了高度耐药人胃癌DDP耐药细胞系，为深入研究肿瘤耐药性发生的原因和机制提供基础。第二方面，本专利技术实施例提供了一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP，利用本专利技术实施例第一方面提供的任一项技术方案所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法得到，所述一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的保藏号为CCTCCNO:C202074。作为本专利技术第二方面的一个优选实施例，所述人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP细胞对DDP的半数抑止浓度IC50为7.59±0.22μg/ml，所述人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP细胞对人胃癌细胞系MGC803细胞的DDP耐药系数RI为13.4±0.91。作为本专利技术第二方面的一个优选实施例，所述人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP细胞对0.05μg/ml、0.1μg/ml和0.2μg/ml三个DDP浓度的相对克隆形成率分别为98.83±1.19％、97.65±1.09％和96.48±1.99％，各组之间统计学差异P值大于0.05。作为本专利技术第二方面的一个优选实施例，所述人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP细胞对人胃癌细胞系MGC803的细胞在0.25μg/mlDDP浓度的相对细胞凋亡率分别为2.25±0.25％和20.11±0.39％，两组之间统计学差异P值小于0.0001；所述人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP细胞对人胃癌细胞系MGC803的细胞在1μg/mlDDP浓度的相对细胞凋亡率分别为5.20±0.53％和64.48±2.42％，两组之间统计学差异P值小于0.0001。与现有技术相比，本专利技术实施例第二方面提供的人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP有益效果与本专利技术实施例第一方面提供任一技术方案所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法有益效果相同，在此不再赘述。第三方面，本专利技术实施例提供了一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的应用，其特征在于，对人胃癌DDP耐药细胞系MGC803/DDP细胞进行miRNA高通量测序筛选出如权利要求8至11中任一项所述的人胃癌DDP耐药细胞系MGC803/DDP细胞和人胃癌细胞系MGC803间的显著差异表达miRNA；所述显著差异表达miRNA包括：hsa-miR-124-3p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-211-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-3180、hsa-miR-3180-3p、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-522-5p、hsa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：/na)对人胃癌细胞系MGC803进行DDP浓度大剂量间歇冲击性诱导，直到在含DDP第一浓度的DMEM培养基中稳定生长，建立人胃癌DDP中度耐药细胞系MGC803/DDP；/nb)通过DDP浓度梯度递增诱导法对所述人胃癌DDP中度耐药细胞系MGC803/DDP持续诱导，直到在含DDP第二浓度的DMEM培养基中维持生长并稳定传代，建立人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP，其中，所述第二浓度大于所述第一浓度；/n其中，对所述人胃癌DDP耐药细胞系MGC803/DDP细胞进行miRNA高通量测序筛选出所述人胃癌DDP耐药细胞系MGC803/DDP细胞和人胃癌细胞系MGC803间的显著差异表达miRNA；所述显著差异表达miRNA包括：hsa-miR-124-3p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-211-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-3180、hsa-miR-3180-3p、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-522-5p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-518e-5p、hsa-miR-523-5p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-7977、hsa-miR-543、hsa-miR-433-3p、hsa-miR-1244、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-124-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-3913-5p和hsa-miR-181a-2-3p；/n通过数据库中Kaplan-Meier生存图使用Kaplan-Meier生存数据进行了大队列分析，对所述显著差异表达miRNA进行筛选，获得在人胃癌中与总体生存有显著相关性的第一生物标记物miRNA，所述显著相关性第一生物标记物miRNA包括：miR-9-3p，miR-9-5p，miR-146a-5p，miR-370-3p，miR-433-3p，miR-519a-5p和miR-522-5p；/n通过RT-qPCR检测人胃癌患者血清样本和人胃癌细胞，在所述第一生物标记物miRNA中筛选出作为区分人胃癌DDP耐药患者和人胃癌DDP敏感患者的第二生物标志物miRNA，其中，所述第二生物标志物miRNA包括：miR-9-3p、miR-9-5p、miR-146a-5p和miR-433-3p；/n通过ROC曲线预测所述第二生物标志物对DDP化疗反应的诊断效能，筛选出作为区分确切的预测耐药性和生存不良的第三生物标志物miRNA，其中，所述第三生物标志物miRNA包括：miR-9-5p+miR-9-3p联合模型、miR-9-5p+miR-433-3p联合模型、miR-9-5p+miR-9-3p+miR-433-3p联合模型和miR-9+miR-433联合模型；/n通过受试者工作特征ROC曲线预测所述第二生物标志物对DDP化疗反应的诊断效能，筛选出作为区分确切的预测耐药性和生存不良的第三生物标志物miRNA，其中，所述第三生物标志物miRNA为miR-9-5p+miR-9-3p+miR-433-3p联合模型。/n...

【技术特征摘要】
1.一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
a)对人胃癌细胞系MGC803进行DDP浓度大剂量间歇冲击性诱导，直到在含DDP第一浓度的DMEM培养基中稳定生长，建立人胃癌DDP中度耐药细胞系MGC803/DDP；
b)通过DDP浓度梯度递增诱导法对所述人胃癌DDP中度耐药细胞系MGC803/DDP持续诱导，直到在含DDP第二浓度的DMEM培养基中维持生长并稳定传代，建立人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP，其中，所述第二浓度大于所述第一浓度；
其中，对所述人胃癌DDP耐药细胞系MGC803/DDP细胞进行miRNA高通量测序筛选出所述人胃癌DDP耐药细胞系MGC803/DDP细胞和人胃癌细胞系MGC803间的显著差异表达miRNA；所述显著差异表达miRNA包括：hsa-miR-124-3p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-211-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-3180、hsa-miR-3180-3p、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-522-5p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-518e-5p、hsa-miR-523-5p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-7977、hsa-miR-543、hsa-miR-433-3p、hsa-miR-1244、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-124-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-3913-5p和hsa-miR-181a-2-3p；
通过数据库中Kaplan-Meier生存图使用Kaplan-Meier生存数据进行了大队列分析，对所述显著差异表达miRNA进行筛选，获得在人胃癌中与总体生存有显著相关性的第一生物标记物miRNA，所述显著相关性第一生物标记物miRNA包括：miR-9-3p，miR-9-5p，miR-146a-5p，miR-370-3p，miR-433-3p，miR-519a-5p和miR-522-5p；
通过RT-qPCR检测人胃癌患者血清样本和人胃癌细胞，在所述第一生物标记物miRNA中筛选出作为区分人胃癌DDP耐药患者和人胃癌DDP敏感患者的第二生物标志物miRNA，其中，所述第二生物标志物miRNA包括：miR-9-3p、miR-9-5p、miR-146a-5p和miR-433-3p；
通过ROC曲线预测所述第二生物标志物对DDP化疗反应的诊断效能，筛选出作为区分确切的预测耐药性和生存不良的第三生物标志物miRNA，其中，所述第三生物标志物miRNA包括：miR-9-5p+miR-9-3p联合模型、miR-9-5p+miR-433-3p联合模型、miR-9-5p+miR-9-3p+miR-433-3p联合模型和miR-9+miR-433联合模型；
通过受试者工作特征ROC曲线预测所述第二生物标志物对DDP化疗反应的诊断效能，筛选出作为区分确切的预测耐药性和生存不良的第三生物标志物miRNA，其中，所述第三生物标志物miRNA为miR-9-5p+miR-9-3p+miR-433-3p联合模型。


2.根据权利要求1所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述步骤b)具体包括以下步骤：
b1)向中度耐药细胞系MGC803/DDP处于对数生长期细胞中加入含梯度浓度DDP的DMEM培养基，继续培养48h；
b2)弃除含DDP的DMEM培养基，换用含维持浓度DDP的DMEM培养基进行培养，并每天更换新鲜含维持浓度DDP的DMEM培养基，直到传代后待细胞生长状态良好，存活细胞恢复生长并进入对数生长期再加入诱导浓度顺铂的DMEM完全培养基；
重复上述步骤b1)-b2)，直到在含DDP第二浓度的DMEM培养基中维持生长并稳定传代，建立人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP。


3.根据权利要求2所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述步骤b1)中含梯度浓度DDP的DMEM培养基以含2.5μg/mlDDP浓度的DMEM培养基为起始，每次递增0.5μg/mlDDP浓度。


4.根据权利要求2所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述步骤b2)中所述对进入对数生长期再加入诱导浓度DDP的DMEM完全培养基的诱导浓度DDP根据存活细胞增殖情况变化而进行设置。


5.根据权利要求2所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述步骤b2)中含维持浓度DDP的DMEM培养基为含1μg/mlDDP浓度的DMEM培养基。


6.根据权利要求1所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述含DDP第一浓度的DMEM培养基为含2.5μg/ml的DMEM培养基，所述含DDP第二浓度的DMEM培养基为含5μg/ml的DMEM培养基。


7.根据权利要求1所述的一种人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP的培养方法，其特征在于，所述人胃癌DDP高度耐药细胞系MGC803/DDP在含2μg/mlDDP浓度的DMEM培养基中维持其耐药性，在用于实验前一周撤去含DDP的DMEM培养基，并且在细胞传代一...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳磊，张楠，徐博栋，张忠涛，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京;11