一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法技术方案

本发明专利技术提供了一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法，该分离系统包括：微流控芯片1、给液模块2、磁场产生模块3、收集模块4、通道和与所述模块分别连接的控制器；所述通道包括：主通道、介质供给支通道和废液收集支通道；所述方法包括：步骤1，对血液样本的过滤；步骤2，对所述步骤1过滤的CTCs与免疫磁性粒子的孵育和结合，用于特异性磁性标记CTCs；步骤3，对免疫磁性粒子标记的CTCs的提纯。本发明专利技术提供的技术方案将过滤、结合、富集功能集成于微流控芯片上，通过控制器实现了对血液样本过滤和CTCs与免疫磁性粒子结合的CTCs双重捕获，从而提高了CTCs的捕获率和捕获纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法
本专利技术涉及微流控芯片以及医疗检测
，具体讲涉及一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)是指由原发灶脱落，侵入外周血液循环的肿瘤细胞，CTCs是近30年来研究应用的仅有的几个新型肿瘤分子标志物之一，通过检测CTCs数量和蛋白表达可对肿瘤进行早期诊断、肿瘤预后判断和实时监测疗效等，具有非常重要的临床意义。目前分离CTCs的方法主要有三大类：微孔滤膜分离方法、免疫磁分离方法和微流控芯片分离方法。微孔滤膜分离方法，在柔性膜上通过设计微米级的孔，将尺寸较大的CTCs截留在滤膜上，实现分离。申请号为CN201621375772.4的中国专利公布了一种高通量快速提纯循环肿瘤细胞的设备，其包括：过滤模块；所述过滤模块包括过滤器、设置在过滤器内并与过滤器内壁密封的滤膜、负压装置；所述负压装置连接在所述过滤器的出口一端，用以使所述过滤器的内部保持负压；所述滤膜用于当所述负压装置的所述过滤器内部保持负压时，截留循环肿瘤细胞，并由所述试剂进样模块自动加入的试剂对其染色和清洗，该装置将样本液输入到过滤器和负压装置，进而使滤膜截留并染色循环肿瘤细胞，该过程具有自动化程度高，高通量等效果。但该专利公布的技术方案将CTCs截留在滤膜上的同时也会截留白细胞等其它杂质细胞，CTCs纯度低，不利于对CTCs的观察和培养。基于免疫磁分离手段实现循环肿瘤细胞捕获也是较常用的分离方法，该法分为正向分离和负向分离，正向分离是免疫磁珠与CTCs特异性结合，收集到CTCs，正向分离的特点是具有较高的富集效率。最具代表的是美国强生公司生产的CellSearch，也是全球唯一通过美国食品和药品监督管理局FDA认证的肿瘤细胞分离和计数系统，标记有抗EpCAM抗体的磁性粒子与靶细胞结合，在外加磁场作用下实现CTCs的分离。但是由于血液中CTCs含量很低，用该系统检测不仅存在假阴性率较高的问题，而且还存在通量低、检测时间长等问题；负向分离是免疫磁珠与白细胞等杂质细胞结合，去除血液中的其它细胞，而后剩余的细胞即为CTCs。负向分离的优点是CTCs没有被免疫磁珠标记，有利于后续观察和培养。但是由于血液细胞数量巨大，所以需用较多的免疫磁珠，而增加成本，剩余的CTCs纯度也较低，其中残留有未被特异性结合的红、白细胞，因此负向分离方法应用较少。申请号为CN201610344918.7的中国专利公开了一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片及其分离纯化方法。循环肿瘤细胞自动分离纯化的微流控芯片包括分离纯化室、分流柱以及微柱，分离纯化室具有样品入口、用于供靶标细胞流出的第一出口以及多个用于供非靶标细胞流出的第二出口。分离纯化室内具有两个微柱阵列，每个微柱阵列由多个微柱行组成，每个微柱行上具有多个微柱，微柱行上相邻的两个微柱之间具有间隙且该间隙用于供靶标细胞通过的靶标细胞通道，该靶标细胞通道的宽度大于非靶标细胞通道的宽度；微柱行与靶标细胞通道夹有锐角，该锐角朝向样品入口。循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片分离纯化纯度高。该法对于微流控芯片的微米级尺寸加工精度要求比较高，细胞通道只有几微米到几十微米，限制了样品的流速，流速高会破坏微流控芯片通道结构并使血细胞残留，该专利公布的微流控芯片的分离方法同样存在通量低、检测时间长的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法，本专利技术提供的方法通过微流控芯片的模块功能组合以及外围的功能化模块，使微流控芯片具有优异的综合处理功能以及良好的控制能力，提高稀有细胞与抗体结合效率，解决现有技术中利用免疫亲和阳性富集法捕获、分离CTC时，所用免疫磁珠多、成本高、捕获效率低、活性降低等弊端，有效提高CTC与抗体的结合效率。本专利技术提供一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法，该分离系统包括：微流控芯片1、给液模块2、磁场产生模块3、收集模块4、通道和控制器；所述通道包括：用于连接所述微流控芯片1的过滤洗脱膜块1-1、气栓去除模块1-2、结合模块1-3、富集模块1-4和所述收集模块4中CTCs富集样本收集器4-1的主通道；用于向过滤洗脱膜块1-1供给介质的介质支通道；用于向结合模块1-3供给免疫磁性粒子的设有开关部件14的免疫磁性粒子支通道；用于收集所述过滤洗脱模块滤液的设有开关部件16的前废液收集支通道；和用于收集所述富集模块1-4滤液的设有开关部件17的后废液收集支通道；所述介质支通道包括：两端分别位于所述过滤洗脱膜块1-1横向和纵向且在其横向上设有左开关部件11和右开关部件12的共用通道；一端与洗液给液器2-2连接，另一端与所述左11和右12开关部件间的共用通道连接的洗液支通道；一端与所述血液样本给液器2-1连接，另一端连接于所述右开关部件12外侧且与所述共用通道纵向连接的且设有开关部件13的血液样本支通道；其改进之处在于，所述方法包括：步骤1.对血液样本的过滤；步骤2.经所述步骤1过滤的CTCs与免疫磁性粒子的孵育和结合，用于特异性磁性标记CTCs；步骤3.对免疫磁性粒子标记的CTCs的提纯。其中，步骤1包括：步骤1-1.将所述过滤洗脱模块1-1置于夹持装置5的过滤夹持结构中，在所述控制器的控制下，打开所述开关部件13和所述前废液收集支通道上的开关部件16实现对血液样本的过滤；步骤1-2.在给液控制器2-4的控制下，关闭所述开关部件13；步骤1-3.打开所述右开关部件12，使洗液流经过滤洗脱膜块1-1直至滤膜上血液颜色消失，滤液经前废液收集通道进入废液收集器4-2，自动化臂将过滤洗脱模块1-1的夹持装置5的过滤夹持件更换为冲洗夹持装置后，再压力封合；步骤1-4.所述磁场控制器3-3控制所述结合模块1-3磁场和富集模块1-4磁场，使所述结合模块1-3磁场为均匀分布的磁场，并使所述富集模块1-4底部一侧的磁场为间歇式强磁场；步骤1-5.在给液控制器2-4的控制下，关闭所述右开关部件12，开启所述开关部件14，以低于1mL/min流速给所述结合模块1-3供给免疫磁性粒子，免疫磁性粒子停留在结合模块1-3；步骤1-6.关闭所述开关部件14和所述开关部件16。其中，所述步骤1中，所述过滤和冲洗均以液体自身的驱动力为动力，该步骤中的介质的流速在15mL/min以内。其中，打开所述开关部件11和17，用洗液冲洗滤膜，将截留于所述过滤洗脱模块1-1滤膜上的CTCs释放出来；在所述结合模块磁铁3-1作用下，使流入结合模块1-3的CTCs与结合模块1-3内静止的免疫磁性粒子特异性孵育结合，形成CTCs-免疫磁性粒子的复合结构。撤除结合模块磁铁3-1，其中的CTCs-免疫磁性粒子的复合结构在流体力和富集模块1-4磁场作用下停留于该富集模块1-4，废液进入收集器4-2；关闭所述开关部本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法，该分离系统包括：微流控芯片(1)、给液模块(2)、磁场产生模块(3)、收集模块(4)、通道和控制器；/n所述通道包括：用于连接所述微流控芯片(1)的过滤洗脱膜块(1-1)、气栓去除模块(1-2)、结合模块(1-3)、富集模块(1-4)和所述收集模块(4)中CTCs富集样本收集器(4-1)的主通道；/n用于向过滤洗脱膜块(1-1)供给介质的介质支通道；/n用于向结合模块(1-3)供给免疫磁性粒子的设有开关部件(14)的免疫磁性粒子支通道；/n用于收集所述过滤洗脱模块滤液的设有开关部件(16)的前废液收集支通道；/n和用于收集所述富集模块(1-4)滤液的设有开关部件(17)的后废液收集支通道；/n所述介质支通道包括：/n两端分别位于所述过滤洗脱膜块(1-1)横向和纵向且在其横向上设有左开关部件(11)和右开关部件(12)的共用通道；/n一端与洗液给液器(2-2)连接，另一端与所述左(11)和右(12)开关部件间的共用通道连接的洗液支通道；/n一端与所述血液样本给液器(2-1)连接，另一端连接于所述右开关部件(12)外侧且与所述共用通道纵向连接的且设有开关部件(13)的血液样本支通道；/n其特征在于，所述方法包括：/n步骤1.对血液样本的过滤；/n步骤2.经所述步骤1过滤的CTCs与免疫磁性粒子的孵育和结合，用于特异性磁性标记CTCs；/n步骤3.对免疫磁性粒子标记的CTCs的提纯。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法，该分离系统包括：微流控芯片(1)、给液模块(2)、磁场产生模块(3)、收集模块(4)、通道和控制器；
所述通道包括：用于连接所述微流控芯片(1)的过滤洗脱膜块(1-1)、气栓去除模块(1-2)、结合模块(1-3)、富集模块(1-4)和所述收集模块(4)中CTCs富集样本收集器(4-1)的主通道；
用于向过滤洗脱膜块(1-1)供给介质的介质支通道；
用于向结合模块(1-3)供给免疫磁性粒子的设有开关部件(14)的免疫磁性粒子支通道；
用于收集所述过滤洗脱模块滤液的设有开关部件(16)的前废液收集支通道；
和用于收集所述富集模块(1-4)滤液的设有开关部件(17)的后废液收集支通道；
所述介质支通道包括：
两端分别位于所述过滤洗脱膜块(1-1)横向和纵向且在其横向上设有左开关部件(11)和右开关部件(12)的共用通道；
一端与洗液给液器(2-2)连接，另一端与所述左(11)和右(12)开关部件间的共用通道连接的洗液支通道；
一端与所述血液样本给液器(2-1)连接，另一端连接于所述右开关部件(12)外侧且与所述共用通道纵向连接的且设有开关部件(13)的血液样本支通道；
其特征在于，所述方法包括：
步骤1.对血液样本的过滤；
步骤2.经所述步骤1过滤的CTCs与免疫磁性粒子的孵育和结合，用于特异性磁性标记CTCs；
步骤3.对免疫磁性粒子标记的CTCs的提纯。


2.如权利要求1所述的一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法，其特征在于，步骤1包括：
步骤1-1.将所述过滤洗脱模块(1-1)置于夹持装置(5)的过滤夹持结构中，在所述控制器的控制下，打开所述开关部件(13)和所述前废液收集支通道上的开关部件(16)实现对血液样本的过滤；
步骤1-2.在给液控制器(2-4)的控制下，关闭所述开关部件(13)；
步骤1-3.打开所述右开关部件(12)，使洗液流经过滤洗脱膜块(1-1)直至滤膜上血液颜色消失，滤液经前废液收集通道进入废液收集器(4-2)，自动化臂将过滤洗脱模块(1-1)的夹持装置(5)的过滤夹持件更换为冲洗夹持装置后，再压力封合；
步骤1-4.所述磁场控制器(3-3)控制所述结合模块(1-3)磁场和富集模块(1-4)磁场，使所述结合模块(1-3)磁场为均匀分布的磁场，并使所述富集模块(1-4)底部一侧的磁场为间歇式强磁场；
步骤1-5.在给液控制器(2-4)的控制下，关闭所述右开关部件(12)，开启所述开关部件(14)，以低于1mL/min流速给所述结合模块(1-3)供给免疫磁性粒子，免疫磁性粒子停留在结合模块(1-3)；
步骤1-6.关闭所述开关部件(14)和所述开关部件(16)。


3.如权利要求2所述的一种基于循环肿瘤细胞正向分离系统的分离方法，其特征在于，所述步骤1中，
所述过滤和冲洗均以液体自身的驱动力为动力，该步骤中...

【专利技术属性】
技术研发人员：许诺，王忠晶，王一凡，刘立滨，
申请(专利权)人：北京机械设备研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11