一种肺癌类器官专用培养基及培养方法技术

本发明专利技术提供一种肺癌类器官专用培养基及培养方法，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括：GSK429286A；Y27632；EGF；BMP4；Human FGF4；胰岛素‑转铁蛋白‑硒(Insulin‑Transferrin‑Selenium)；B27；全反式维A酸(all‑trans retinoic acid)；KGF；DAPT；GlutaMAX；R‑Spondin‑1；CHIR99021；8‑Br‑cAMP；牛血清白蛋白(BSA)；磷酸二酯酶(PDEs)抑制剂。本发明专利技术的培养基可实现肺癌类器官的快速生长，并可长期稳定培养，形成的肿瘤类器官细胞球球形规则，且大小较为均一，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性。

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌类器官专用培养基及培养方法
本专利技术属于类器官培养
，具体涉及一种肺癌类器官专用培养基及培养方法。
技术介绍
肺癌是威胁人类健康和生命安全的恶性肿瘤之一，世界范围内每年约有100万-300万人死于肺癌。在我国肺癌也成为威胁人类生命的首位恶性肿瘤，每年死亡人数约为60万，且有逐年增加的趋势。尽管近年随着分子生物学的发展，研究者利用各种肺癌细胞系在肺癌的发病机制及治疗等方面取得了突破性进展，但由于遗传背景的差异，不同患者发病的分子机制及治疗均存在个体化的特点。目前，肺癌的个体化治疗基于三个层面：临床学、分子学和细胞学；其中细胞学层面因素是通过检测肿瘤细胞的药敏结果来确定，但因细菌药敏和肿瘤细胞系药敏与临床应用价值差异较大，故急需建立新的体外替身药敏模型来根据临床情况选择合理化综合治疗方案，从而使患者得到更好的治疗或者治愈。通过肿瘤患者自体的肿瘤组织培养的原代肿瘤胞能表现出肿瘤原来的特性，是肿瘤在体外研究的重要手段。类器官是一种3维细胞培养物，包含其来源组织的一些关键特征；肺癌组织的类器官培养是指从肺癌患者体内取出的肿瘤组织进行培养，由于培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能、分化及药物治疗等研究。然而目前国内在建立肺癌类器官培养方法的研究技术存在空白，主要问题在于肺癌类器官的专用培养体系开发存在难度。如果能够成功研究出肺癌类器官的培养技术，将为肺癌患者药物研发、药敏检测与药物筛选提供理想的体外模型，无疑会给我国肺癌患者带来诸多福音。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提供一种肺癌类器官专用培养基及培养方法以解决上述问题。本专利技术的技术方案为：第一个方面，本专利技术提供一种肺癌类器官专用培养基，包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括：GSK429286A；Y27632；EGF；BMP4；HumanFGF4；胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium)；B27；全反式维A酸(all-transretinoicacid)；KGF；DAPT；GlutaMAX；R-Spondin-1；CHIR99021；8-Br-cAMP；牛血清白蛋白(BSA)；磷酸二酯酶(PDEs)抑制剂。进一步地，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A，2-20uM；Y27632，2-20uM；EGF，10-500ng/ml；BMP4，10-500ng/ml；HumanFGF4，50-1000ng/ml；Insulin-Transferrin-Selenium，0.5-2x；B27，0.5-3x；all-transretinoicacid，0.1-1uM；KGF，10-500ng/ml；DAPT，2-20mM；GlutaMAX，0.5-2x；R-Spondin-1，100-1000ng/ml；CHIR99021，1-20uM；8-Br-cAMP，10-200nM；BSA，0.1％－1％；PDEs抑制剂，10-200nM，前述的百分比为质量百分比。优选地，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A，5-15uM；Y27632，5-12.5uM；EGF，50-200ng/ml；BMP4，50-200ng/ml；HumanFGF4，200-600ng/ml；Insulin-Transferrin-Selenium，0.75-1.5x；B27，0.75-1.5x；all-transretinoicacid，0.4-0.6uM；KGF，50-200ng/ml；DAPT，5-15mM；GlutaMAX，0.75-1.25x；R-Spondin-1，300-800ng/ml；CHIR99021，5-10uM；8-Br-cAMP，50-150nM；BSA，0.2-0.6％；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，50-150nM，前述的百分比为质量百分比。优选地，所述基础培养基为DMEM/F12(1:1)培养基。进一步地，所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。第二个方面，本专利技术提供一种肺癌类器官培养方法，包括以下步骤：1)将分离的肺癌组织进行预处理后经两次消化，收集细胞沉淀；2)将细胞沉淀裂解，然后与matrigel胶混匀并接种，待混合胶凝固后加入上述培养基，并于37℃、5％CO2浓度下培养6-14天，即得。进一步地，所述步骤1)中第一次消化的过程控制包括：采用“消化液1”，所述“消化液1”包括200-1000ng/ml的Hydrocortistone和200-1000U/ml的Collagenase酶typeⅣ，将肺癌组织于37℃、220rpm条件下消化2～3h，加入HBSS终止消化，离心得到一次消化的细胞沉淀。进一步地，所述步骤1)中第二次消化的过程控制包括：采用“消化液2”，所述“消化液2”的组分包括2-20mg/ml的dispaseII、0.2-2mg/ml的DNA酶，将一次消化的细胞沉淀于37℃、220rpm条件下消化15～20min，加入HBSS终止消化，离心得到二次消化的细胞沉淀。进一步地，所述步骤1)还包括：将两次消化获得的细胞沉淀用HBSS重悬后过100μm细胞滤网，之后离心收集细胞沉淀。第三个方面，本专利技术提供一种肺癌类器官，是采用上述培养方法获得。本专利技术的有益效果是：①本专利技术的培养基可实现肺癌类器官的快速生长，并可长期稳定培养，形成的肿瘤类器官活性较好，细胞球间连接紧密，且类器官直径较大，能在体外很好地保留患者肿瘤组织的异质性。②本专利技术的培养方法操作简单，人员操作影响较少，稳定性高。附图说明图1为本专利技术实施例1中培养0天的肿瘤细胞的形态图。图2为本专利技术实施例1中培养3天的肿瘤细胞的形态图。图3为本专利技术实施例1中培养6天的肿瘤细胞的形态图。图4为本专利技术实施例1中培养12天的肿瘤细胞的形态图。图5为本专利技术实施例2培养14天获得的肺癌类器官的结构形态图。图6为本专利技术实施例3培养14天获得的肺癌类器官的结构形态图。图7为本专利技术实施例4培养14天获得的肺癌类器官的结构形态图。图8为本专利技术实施例5中培养30天的肿瘤细胞的形态图。图9为本专利技术实施例5中培养90天的肿瘤细胞的形态图。图10为本专利技术实施例5中培养120天的肿瘤细胞的形态图。图11为本专利技术实施例5中培养180天的肿瘤细胞的形态图。图12为本专利技术对比例1中培养5天的肿瘤细胞的形态图。图13为本专利技术对比例1中培养10天的肿瘤细胞的形态图。图14为本专利技术对比例2中培养14天的肿瘤细胞的形态图。图15为本专利技术对比例3中培养14天的肿瘤细胞的形态图。具体实施方式在本专利技术的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肺癌类器官专用培养基，其特征在于：包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括：GSK429286A；Y27632；EGF；BMP4；Human FGF4；胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium)；B27；全反式维A酸(all-trans retinoic acid)；KGF；DAPT；GlutaMAX；R-Spondin-1；CHIR99021；8-Br-cAMP；牛血清白蛋白(BSA)；磷酸二酯酶(PDEs)抑制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种肺癌类器官专用培养基，其特征在于：包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括：GSK429286A；Y27632；EGF；BMP4；HumanFGF4；胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium)；B27；全反式维A酸(all-transretinoicacid)；KGF；DAPT；GlutaMAX；R-Spondin-1；CHIR99021；8-Br-cAMP；牛血清白蛋白(BSA)；磷酸二酯酶(PDEs)抑制剂。


2.根据权利要求1所述的一种肺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A，2-20uM；Y27632，2-20uM；EGF，10-500ng/ml；BMP4，10-500ng/ml；HumanFGF4，50-1000ng/ml；Insulin-Transferrin-Selenium，0.5-2x；B27，0.5-3x；all-transretinoicacid，0.1-1uM；KGF，10-500ng/ml；DAPT，2-20mM；GlutaMAX，0.5-2x；R-Spondin-1，100-1000ng/ml；CHIR99021，1-20uM；8-Br-cAMP，10-200nM；BSA，0.1％－1％；PDEs抑制剂，10-200nM，前述的百分比为质量百分比。


3.根据权利要求2所述的一种肺癌类器官专用培养基，其特征在于：所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：GSK429286A，5-15uM；Y27632，5-12.5uM；EGF，50-200ng/ml；BMP4，50-200ng/ml；HumanFGF4，200-600ng/ml；Insulin-Transferrin-Selenium，0.75-1.5x；B27，0.75-1.5x；all-transretinoicacid，0.4-0.6uM；KGF，50-200ng/ml；DAPT，5-15mM；GlutaMAX，0.75-1.25x；R-Spondin-1，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：于言，朱宇，李刚，黄敏，
申请(专利权)人：创芯国际生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44