一种脑肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种脑肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法。本发明专利技术提供了脑肿瘤实体瘤原代细胞培养方法及配套试剂，该技术核心是：用温和细胞解离试剂处理脑肿瘤实体瘤组织，最大程度保证了组织中肿瘤细胞活力；配制特殊无血清培养基，利用悬浮培养体系对脑肿瘤来源的实体瘤细胞进行体外培养，保证肿瘤细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。利用本发明专利技术方法得到的脑肿瘤实体瘤原代细胞培养物可用于多种细胞水平体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可预见，这种培养方法在脑肿瘤的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种脑肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种脑肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法。
技术介绍
脑部肿瘤是指生长在颅腔的新生物，又称颅内肿瘤、脑癌，可起源于脑、脑膜、神经、血管及脑附件，或由身体的其他组织或脏器转移侵入颅内而形成，大都可产生头痛、颅内高压及局灶性症状。脑瘤的发生率约为1.9-5.4人/(年·10万人)，占全身各种肿瘤的5％。脑胶质瘤是最常见的脑肿瘤，占脑部肿瘤发病率的约60％，其中胶质母细胞瘤(WHO4级)患者的中位生存期仅14.6～17个月，5年生存率不足10％。尽管世界各国的科研和医疗机构对脑肿瘤的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。脑肿瘤是一类复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。脑肿瘤的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。并且部分类型的脑肿瘤缺乏可用于基础科研和药物开发的细胞系，极大地制约了脑肿瘤新型诊疗研发的进展。因此将脑肿瘤实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是脑肿瘤研究领域乃至脑肿瘤诊断治疗领域的趋势。现有的原代肿瘤细胞培养技术主要有2D培养，3D培养，重编程培养等几类，这些方法都不同程度的面临培养周期极长，培养成功率低，杂细胞难以去除等问题。
技术实现思路
为了有效解决上述技术问题，本专利技术提供了一种新的脑肿瘤实体瘤原代细胞培养技术及配套试剂，该技术的核心是：(1)用温和细胞解离试剂处理脑肿瘤实体瘤组织，最大程度的保证了组织中肿瘤细胞的活力；(2)配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对脑肿瘤实体瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养，保证肿瘤细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。第一方面，本专利技术要求保护一种培养脑肿瘤实体瘤原代细胞的方法。本专利技术所要求保护的培养脑肿瘤实体瘤原代细胞的方法，可包括如下步骤：利用脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养脑肿瘤实体瘤原代细胞；所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、人重组蛋白VEGF、人重组蛋白GDNF、A83-01(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide)、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、N-2Supplement、SB431542、Y-27632、CHIR99021和AdvancedDMEM/F12培养基组成。其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES的终浓度为8-12mM(如10mM)；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白VEGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白GDNF的终浓度为50-200ng/mL；所述A83-01的终浓度为0.25-1.25μM；所述N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)的终浓度为0.5-2mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述SB431542的终浓度为1-5μM；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；所述CHIR99021的终浓度为1-5μM；余量均为AdvancedDMEM/F12培养基。进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为抗真菌剂。所述GlutaMAX为“GlutaMAXTMSupplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述“GlutaMAXTMSupplement”的成分为L-alanyl-L-glutamine，是L-glutamine的替代物，浓度为200nM，溶剂为0.85％NaCl溶液。所述N-2Supplement为“N-2Supplement(100X)”(如Gibco#17502001，或与其组成相同的其他产品)。所述“N-2Supplement(100X)”中含有终浓度为1mM的人全铁转铁蛋白(HumanTransferrin(Holo))、500mg/L的重组胰岛素全链(InsulinRecombinantFullChain)、0.63mg/L的孕酮(Progesterone)、10mM的腐胺(Putrescine)、0.52mg/L的亚硒酸盐(Selenite)。所述GlutaMAX是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。所述GlutaMAX为“GlutaMAXTMSupplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述Y-27632为“Y-27632dihydrochloride(一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，Ki分别为220nM和300nM)”(如MCE#129830-38-2，或与其组成相同的其他产品)。所述SB431542是一种有效的，选择性ALK5抑制剂，无细胞试验中IC50为94nM，对ALK5的作用比对p38、MAPK和其他激酶强100倍。所述CHIR-99021具体为“CHIR-99021(CT99021)HCl”(如Selleck#S2924，或与其组成相同的其他产品)。所述CHIR-99021(CT99021)HCl是CHIR-99021的盐酸盐，是GSK-3α/β抑制剂，IC50为10nM/6.7nM。其对GSK-3的选择性比对Cdc2和ERK2高500倍以上。在本专利技术的具体实施例中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述GlutaMAX的品牌货号为Gibco#35050061；所述人重组蛋白bFGF的品牌货号为Peprote本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养脑肿瘤实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：利用脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养脑肿瘤实体瘤原代细胞；/n所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、人重组蛋白VEGF、人重组蛋白GDNF、A83-01、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-2Supplement、SB431542、Y-27632、CHIR99021和Advanced DMEM/F12培养基组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL；所述HEPES的终浓度为8-12mM；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白VEGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白GDNF的终浓度为50-200ng/mL；所述A83-01的终浓度为0.25-1.25μM；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的终浓度为0.5-2mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述SB431542的终浓度为1-5μM；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；所述CHIR99021的终浓度为1-5μM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。/n...

【技术特征摘要】
1.一种培养脑肿瘤实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：利用脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养脑肿瘤实体瘤原代细胞；
所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、人重组蛋白VEGF、人重组蛋白GDNF、A83-01、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-2Supplement、SB431542、Y-27632、CHIR99021和AdvancedDMEM/F12培养基组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL；所述HEPES的终浓度为8-12mM；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白VEGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白GDNF的终浓度为50-200ng/mL；所述A83-01的终浓度为0.25-1.25μM；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的终浓度为0.5-2mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述SB431542的终浓度为1-5μM；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；所述CHIR99021的终浓度为1-5μM；余量均为AdvancedDMEM/F12培养基。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脑肿瘤实体瘤原代细胞是用样本解离液对脑肿瘤实体瘤组织进行解离处理后获得的；
所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；余量均为PBS；
进一步地，是按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述脑肿瘤实体瘤组织进行解离的：按0.1-0.3mL所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述脑肿瘤实体瘤组织用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，是按照包括如下步骤的方法用所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述脑肿瘤实体瘤原代细胞的：使用细胞培养容器M，利用所述脑肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述脑肿瘤实体瘤原代细胞，37℃，5％CO2条件下进行培养，每2-4天更换一次培养基；
所述细胞培养容器M为如下任一：(I)聚苯乙烯材质的细胞培养容器、聚碳酸酯材质的细胞培养容器、聚甲基丙烯酸甲酯材质的细胞培养容器、COC树脂材质的细胞培养容器、环烯烃聚合物材质的细胞培养容器或低吸附表面的细胞培养容器；(II)对(I)中的细胞培养容器进行CYTOP修饰后的细胞培养容器；
进一步地，所述细胞培养容器为细胞培养皿、细胞培养孔板或用于细胞培养的微孔板芯片；
进一步地，所述(II)中，是按照包括如下步骤的方法对所述(I)中的细胞培养容器进行CYTOP修饰的：对所述(I)中的细胞培养容器进行纯氧刻蚀，刻蚀条件为功率20W，刻蚀时间为3分钟；然后用1％CYTOP溶液覆盖所述细胞培养容器表面，晾干所述1％CYTOP溶液即完成CYTOP修饰；
更进一步地，所述1％CYTOP溶液的组成如下：每100mL所述1％CYTOP溶液中含有1mLCYTOP...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹申意，张函槊，
申请(专利权)人：北京基石生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11