同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，特别涉及同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒通过大、小微球联用的方法制备试剂来保证试剂能够同时满足测定人血清和尿液时均具有优异的线性和精密度；尿液和血液使用同一个参数，简化检测操作，提高效率。

【技术实现步骤摘要】
同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒。
技术介绍
视黄醇结合蛋白(RBP)是肝脏合成的一种小分子量的脂质运载蛋白，其分子量为21KD，其在体内承担着将视黄醇由肝细胞运输至机体组织和细胞的作用，血清RBP运输视黄醇的方式是与前白蛋白(PA)和视黄醇结合形成大分子复合物，此复合物不能通过肾小球的滤过膜滤从而存在于人体血液中；当复合物到达靶细胞后，视黄醇被靶细胞吸收，RBP解离成小分子量的游离态而进入血清，且能够肾小球滤过，进入到肾小管中被上皮细胞吸收转化成氨基酸供机体再利用，另外有极小部分RBP未被吸收而直接随尿液排出体外。在临床上，血清RBP和尿液RBP的水平可作为机体的肝、肾损伤以及糖尿病等其他综合征的有效检测指标。RBP在肝脏中合成，若肝脏合成功能受损，血清RBP的浓度便会随之降低，且其下降程度与肝脏受损情况高度相关，肝脏损伤越严重，降低程度越大，肝硬化时更低。由于RBP的半衰期较短，反应变化灵敏，更适于作为早期肝功能损伤的指标。视黄醇结合蛋白在肾脏中进行代谢，所以尿液RBP水平对肾病的早期诊断具有十分重要的意义。一些疾病(比如糖尿病、高血压等)导致机体的肾小球功能受损，肾小球滤过受到阻碍，使RBP在血液中积累导致血清RBP含量升高；另外，某些肾脏疾病(比如病毒感染)会导致机体肾小管的重吸收功能受损伤，体液内的RBP进入到肾脏后不能被重吸收，全部随尿液排出体外，导致尿RBP含量升高。除肝脏和肾脏疾病外，RBP还与其他疾病有着密切联系。有研究表明，当胰岛素抵抗力増强会导致血液RBP的浓度升高，从而导致机体肥胖；另外，血清RBP还可反应机体的营养状况，可作为机体早期和亚临床型营养缺乏检测的敏感性指标。目前临床针对视黄醇结合蛋白的诊断方法主要有酶联免疫法、免疫透射比浊法、放射免疫分析法、免疫电泳法、胶乳增强免疫比浊法等。酶联免疫法就是利用抗体与酶的结合，通过酶标二抗的显色情况进行检测。该法作为免疫学中常用的检测方法具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便，实用性强的优点，但其抗干扰能力不强，容易受样本中干扰因素的影响的缺点使其的应用具有一定的局限性。免疫放射分析法是将放射核素标记的抗体和抗原或半抗原结合，形成抗原抗体复合物，其放射性和所加抗原量正相关，通过检测其放射性来确定抗原浓度。此法比较检测速度块和操作简便，且灵敏度高、特异性好，但容易出现交叉反应、假阳性反应等，影响检测结果。免疫电泳是指利用血清或尿液中蛋白质所带电荷的不同和分子量大小的差异来对不同蛋白进行分离的技术，琼脂糖为载体，利用免疫学理论，将琼脂区带电泳与双向扩散相结合产生特异性的沉淀线、弧或峰的一种方法。此法灵敏度髙，但是操作复杂，在大批量的临床标本的检测中不适用。免疫透射比浊法原理是可溶性抗原与相应的抗体发生特异性结合，形成不溶性的免疫复合物，当一定波长的光线通过抗原抗体复合物时，其浊度将发生变化，通过测量其吸光度值可测定相应抗原的浓度。此方法准确性高、操作简单，在临床医学诊断中得到广泛的应用。相比于免疫电泳法的操作复杂、不适用于临床自动化分析，酶联免疫法只能用于定性或半定量分析，放射免疫分析法存在放射污染和安全性等问题，免疫透射比浊法因其操作简便、准确度高、试剂稳定性好、抗干扰能力强、检测成本低等优点成为最值得推广的一种临床自动化检测方法。在免疫比浊法基础上建立了一种灵敏度更高的检测方法，那就是胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是将特异性抗原或抗体包被在胶乳微球表面上，当检测样品中含有对应的抗体或抗原时，两者发生特异性免疫反应后，免疫胶乳微球出现团聚，使样品的浊度增大。与免疫比浊法检测原理相同，根据样品溶液中待测成分的含量与样品的浊度呈正比，通过检测溶液的浊度，即可计算出样品中待测蛋白的含量。该方法可运用全自动生化仪对免疫反应后的溶液直接检测，操作简单、检测快速。市面上的RBP试剂盒大部分使用单粒径的微球来制备试剂2，但是此种方式很难同时满足高线性和低值的高灵敏度。有一些同样采用了大小球联用的专利技术中大小球分别连接不同的抗体，因为抗体不同，所以特异性会有差异，且采用分开偶联的工艺，生产过程较复杂。因此，提供一种可同时测定人血清和尿液视黄醇结合蛋白含量的试剂盒具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合，包括试剂一和试剂二；其中，试剂一包括葡聚糖硫酸钠；试剂二包括标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒；所述乳胶颗粒由抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与乳胶微球偶联制得；所述乳胶微球包括第一胶乳微球和第二胶乳微球；所述第一胶乳微球的粒径为80nm；所述第二胶乳微球的粒径为200nm。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述第一胶乳微球与所述第二胶乳微球的重量比为1:3。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒的制备方法包括：步骤1、微球活化：取粒径为80nm的第一胶乳微球和粒径为200nm的第二胶乳微球以1：3的重量比进行混合，经10mMpH值5的MES缓冲液稀释至浓度为2％(w/w)，以120ml/L的体积比加入浓度为0.5mg/ml的EDC，于20～30℃震荡活化30min，制得微球体系；步骤2、稀释抗体：将抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体和酪蛋白加入至50mmolPH7.0MOPS缓冲液中，所述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体、酪蛋白与所述MOPS缓冲液按照2：1：45的重量比混合均匀，制得稀释后的抗体；步骤3、抗体-微球偶联：将步骤2制得的所述稀释后的抗体匀速6ml/min加入至步骤1制得的所述微球体系中，反应18小时；步骤4、超声：超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；步骤5、离心：于15000rpm离心15min，收集沉淀；步骤6、超声分散：超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm；超声时长：30min/每升试剂；所述沉淀分散于存储液中，制得标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒溶液；所述存储液的组分包括：在本专利技术的一些具体实施方案中，所述标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒溶液中标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒的浓度为0.4％。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂一中所述葡聚糖硫酸钠的分子量为1500～50000，浓度为0.1～2％(w/v)。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂一还包括50～100mMMOPS缓冲液，0.1％～1％(w/w)BSA，1％～5％NaCl，0.1％～1％Tween，0.5％～5％EDTA，所述试剂一的pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合，其特征在于，包括试剂一和试剂二；/n其中，试剂一包括葡聚糖硫酸钠；/n试剂二包括标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒；所述乳胶颗粒由抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与乳胶微球偶联制得；/n所述乳胶微球包括第一胶乳微球和第二胶乳微球；所述第一胶乳微球的粒径为80nm；所述第二胶乳微球的粒径为200nm。/n

【技术特征摘要】
1.同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合，其特征在于，包括试剂一和试剂二；
其中，试剂一包括葡聚糖硫酸钠；
试剂二包括标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒；所述乳胶颗粒由抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体与乳胶微球偶联制得；
所述乳胶微球包括第一胶乳微球和第二胶乳微球；所述第一胶乳微球的粒径为80nm；所述第二胶乳微球的粒径为200nm。


2.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述第一胶乳微球与所述第二胶乳微球的重量比为1:3。


3.如权利要求1或2所述的试剂组合，其特征在于，所述标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的乳胶颗粒的制备方法包括：
步骤1、微球活化：取粒径为80nm的第一胶乳微球和粒径为200nm的第二胶乳微球以1：3的重量比进行混合，经10mMpH值5的MES缓冲液稀释至浓度为2％(w/w)，以120ml/L的体积比加入浓度为0.5mg/ml的EDC，于20～30℃震荡活化30min，制得微球体系；
步骤2、稀释抗体：将抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体和酪蛋白加入至50mmolPH7.0MOPS缓冲液中，所述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体、酪蛋白与所述MOPS缓冲液按照2：1：45的重量比混合均匀，制得稀释后的抗体；
步骤3、抗体-微球偶联：将步骤2制得的所述稀释后的抗体匀速6ml/min加入至步骤1制得的所述微球体系中，反应18小时；
步骤4、超声：超声功率：50％，时间间隔：5s，探头直径：25mm，超声时长：30min/每升试剂；
步骤5、离心：于15000rpm离心15min，收集沉淀；
步骤6、超声分散：超声功率：50％，时间间隔：5s，探头...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨玉莹，
申请(专利权)人：北京安图生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11