一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备及检测方法技术

本发明专利技术涉及POCT化学发光免疫分析技术领域，且公开了一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，试剂盒包括试剂条、吸头、废物盒、试剂条架、标准品、标准品稀释液、样品、样品稀释液、碱性磷酸酶标记抗体和磁珠包被抗体；碱性磷酸酶标记抗体的制备方法包括以下步骤：Ⅰ、抗体的活化；Ⅱ、AP的活化；Ⅲ、AP交联抗体；磁珠包被抗体的制备方法包括以下步骤：一、制备磁珠包被；二、磁珠交联抗体；三、磁珠封闭；四、磁珠清洗和保存。采用本发明专利技术得到的试剂盒进行D‑Dimer检测，可缩短检测时间，提高产品性能，可以帮助更好的诊断血栓疾病，且检测步骤简单，便于操作。

【技术实现步骤摘要】
一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备及检测方法
本专利技术涉及POCT化学发光免疫分析
，具体为一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备及检测方法。
技术介绍
D二聚体增高提示了与体内各种原因引起的血栓性疾病相关，同时也说明了纤溶活性的增强，临床上常见于弥漫性血管内凝血(DIC)、深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、急性心肌梗塞、脑梗塞、恶性肿瘤、卵巢癌、肺癌、败血症、肝病、妊高症孕妇、先兆子痢、烧伤、外科手术、创伤和脓毒血症等均可使D－二聚体升高，但是D－二聚体检测的升高并不能说明血栓形成的原因及位置，必须结合临床和其他检查综合分DIC(休克、系统感染、外伤、先兆子痢、恶性疾病和烧伤等)的并发症，血液在全身微小血管内广泛性凝固，形成以血小板和纤维蛋白为主要成分的微血栓。此过程消耗了大量的血小板和凝血因子，并通过激活途径激活了纤溶系统。微血栓中交联纤维蛋白被纤溶酶降解而产生大量高于正常百倍的D－二聚体。与其他诊断DIC的指标相比较，D－二聚体是唯一直接反映凝血酶和纤溶酶生成的理想指标；诊断DIC的特异性也早于其他指标。深静脉血栓(DVT)的筛查血浆D－二聚体阴性可排除DVT的可能性。造影证实DVT者D－二聚体100％阳性。可作溶栓治疗和肝素抗凝的用药指导及疗效观察；肺栓塞(PE)是一种较常见的潜在致命性疾病，尤其多见于血液病、心脏病和外科手术病人。PE临床表现差异极大且缺乏特异性(从无任何表现到猝死)、常规检查无法获得直接证据，加上对该病的认识不足，常造成漏诊或误诊。及时治疗依赖早期诊断。对于呼吸困难、胸闷、咳嗽、咯血，晕厥的患者，尤其是近期有外伤，手术及长途旅行史；既往患有深静脉血栓，应考虑是否存在PE.D－二聚体测定是PE必备的筛查方法<0.5mg/L可除外PE。现有检测D－二聚体的方法有发色底物法，免疫比浊法，手工ELISA法，但是这些方法检测时间长，敏感度低，特异性差。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备及检测方法，采用本试剂盒进行D-Dimer检测，缩短检测时间，提高产品性能，可以帮助更好的诊断血栓疾病。(二)技术方案为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括试剂条、吸头、废物盒、试剂条架、标准品、标准品稀释液、样品、样品稀释液、碱性磷酸酶标记抗体和磁珠包被抗体；所述碱性磷酸酶标记抗体的制备方法包括以下步骤：Ⅰ、抗体的活化；Ⅱ、AP的活化；Ⅲ、AP交联抗体；所述磁珠包被抗体的制备方法包括以下步骤：一、制备磁珠包被；二、磁珠交联抗体；三、磁珠封闭；四、磁珠清洗和保存优选的，所述抗体的活化包括以下步骤：1)取抗体1毫克，加入0.002mL50mM2-Iminothiolane.Hcl迅速混匀室温+25℃静置反应10分钟；2)加入溶液0.002ml5MGlycine充分混匀，室温+25℃静置反应2分钟；3)过离心式脱盐柱，1500g离心1分钟，测分光光度计0D280mm，计算抗体的浓度(按E01％-1.4计算)；4)用PBS调整浓度至1mg/mL，充分混匀。优选的，所述AP的活化包括以下步骤：①取AP1.5毫克，加入0.0025mL80mMSMCC迅速混匀室温+25℃静置反应10分钟；②加入溶液0.004ml5MGlycine充分混匀，室温+25℃静置反应2分钟；③过离心式脱盐柱，1500g离心1分钟，测分光光度计0D280mm，计算抗体的浓度(按E01％＝1.0计算)；④用PBS调整浓度至5mg/mL，充分混匀。优选的，所述AP交联抗体具体步骤为：(1)立刻将步骤二活化的AP和步骤一活化的抗体以1:2混合在一起，充分混匀，室温+25℃静置反应0.5小时转入冰箱过夜；(2)向上述交联物溶液中加入0.002mLNEM溶液，迅速震荡混匀，室温静置反应30分钟，封闭多余的疏基；(3)终止反应后的交联物加入超滤管，补加缓冲液至0.45mL，10，000xg离心2分钟，浓缩至<0.15mL.补加缓冲液至0.45mL10，000xg离心2分钟，浓缩至<0.2mL，重复3次，最后浓缩至<0.2mL，浓样补加缓冲液至1.2mL，加甘油1.2mL，充分混匀，终体积2.4mL，拟定液度为5mg/mLAb，使用前配成工作液，-20℃保存，得到碱性磷酸酶标记抗体。优选的，所述制备磁珠包被包括以下步骤：一、抗体准备：取1mg抗体；二、磁珠活化：①取磁珠在混匀仪上室温(+25℃)混匀4小时以上，充分混匀并恢复至室温(+25℃)；②取1.00mL磁珠，磁分离2分钟，弃上清；③用缓冲液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，磁分离2分钟，弃上清；④重复洗涤2次；⑤用4.0mL缓冲液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，超声1分钟；⑥加4mL缓冲液，在混匀仪上混匀2分钟；⑦在搅拌的条件下，往磁珠中先后加入4mLNHS溶液和1.5mLEDC溶液，充分混匀；⑧在混匀仪上室温(+25℃)反应30分钟；⑨磁分离2分钟，弃上清；⑩用5mL缓冲液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，磁分离2分钟，拜上清；用5mL缓冲液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，超声1分钟；加4.5mL缓冲液，在混匀仪上混匀2分钟。优选的，所述磁珠交联抗体包括以下步骤：㈠、在搅拌的条件下，往磁珠中加入抗体，用2mLPBS涮洗抗体所用容器后加入磁珠中；㈡、在混匀仪上室温(+25℃)反应24小时。优选的，所述磁珠封闭包括以下步骤：A1、磁分离2分钟，收集上清；A2、用5mL缓冲液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，磁分离2分钟，收集上清；A3、用5mL缓冲液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，磁分离2分钟，弃上清；A4、加5mL缓冲液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，超声1分钟；A5、加5mL缓冲液，在混匀仪上室温(+25℃)反应24小时。优选的，所述磁珠清洗和保存包括以下步骤：S1、磁分离，弃上清；S2、用20mL磁珠洗涤液重悬，在混匀仪上混匀2分钟；磁分离2分钟，弃清S3、重复洗涤2次；S4、用20mL磁珠保存液重悬，在混匀仪上混匀2分钟；磁分离10分钟，弃上清；S5、加5mL磁珠保存液重悬，在混匀仪上混匀2分钟，超声1分钟；S6、加30mL磁珠保存液，在混匀仪上混匀30分钟，终浓度为10毫克/毫升，试用期配成工作液，冰箱保存，得到磁珠包被抗体。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)试验前准备：将试剂条平衡至率温，仪器开机预热至少20分钟；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括试剂条、吸头、废物盒、试剂条架、标准品、标准品稀释液、样品、样品稀释液、碱性磷酸酶标记抗体和磁珠包被抗体；/n所述碱性磷酸酶标记抗体的制备方法包括以下步骤：/nⅠ、抗体的活化；/nⅡ、AP的活化；/nⅢ、AP交联抗体；/n所述磁珠包被抗体的制备方法包括以下步骤：/n一、制备磁珠包被；/n二、磁珠交联抗体；/n三、磁珠封闭；/n四、磁珠清洗和保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括试剂条、吸头、废物盒、试剂条架、标准品、标准品稀释液、样品、样品稀释液、碱性磷酸酶标记抗体和磁珠包被抗体；
所述碱性磷酸酶标记抗体的制备方法包括以下步骤：
Ⅰ、抗体的活化；
Ⅱ、AP的活化；
Ⅲ、AP交联抗体；
所述磁珠包被抗体的制备方法包括以下步骤：
一、制备磁珠包被；
二、磁珠交联抗体；
三、磁珠封闭；
四、磁珠清洗和保存。


2.根据权利要求1所述的一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗体的活化包括以下步骤：
1)取抗体1毫克，加入0.002mL50mM2-Iminothiolane.Hcl迅速混匀室温+25℃静置反应10分钟；
2)加入溶液0.002ml5MGlycine充分混匀，室温+25℃静置反应2分钟；
3)过离心式脱盐柱，1500g离心1分钟，测分光光度计0D280mm，计算抗体的浓度(按E01％-1.4计算)；
4)用PBS调整浓度至1mg/mL，充分混匀。


3.根据权利要求1所述的一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述AP的活化包括以下步骤：
①取AP1.5毫克，加入0.0025mL80mMSMCC迅速混匀室温+25℃静置反应10分钟；
②加入溶液0.004ml5MGlycine充分混匀，室温+25℃静置反应2分钟；
③过离心式脱盐柱，1500g离心1分钟，测分光光度计0D280mm，计算抗体的浓度(按E01％＝1.0计算)；
④用PBS调整浓度至5mg/mL，充分混匀。


4.根据权利要求1所述的一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述AP交联抗体具体步骤为：
(1)立刻将步骤二活化的AP和步骤一活化的抗体以1:2混合在一起，充分混匀，室温+25℃静置反应0.5小时转入冰箱过夜；
(2)向上述交联物溶液中加入0.002mLNEM溶液，迅速震荡混匀，室温静置反应30分钟，封闭多余的疏基；
(3)终止反应后的交联物加入超滤管，补加缓冲液至0.45mL，10，000xg离心2分钟，浓缩至<0.15mL.补加缓冲液至0.45mL10，000xg离心2分钟，浓缩至<0.2mL，重复3次，最后浓缩至<0.2mL，浓样补加缓冲液至1.2mL，加甘油1.2mL，充分混匀，终体积2.4mL，拟定液度为5mg/mLAb，使用前配成工作液，-20℃保存，得到碱性磷酸酶标记抗体。


5.根据权利要求1所述的一种酶促化学发光D－二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备磁珠包被包括以下步骤：
一、抗体准备：取1mg抗体；
二、磁珠活化：
①取磁珠在混匀仪上室温(+25℃)混匀4小时以上，充分混匀并恢复至室温(+25℃)；
②取1.00mL磁珠，磁分离2分钟，弃上...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓兴朝，陈欢，甘筱静，林金昌，
申请(专利权)人：深圳容金科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44