检测血清THBS2表达的肝病纤维化检测试剂、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了THBS2作为一种肝病纤维化进展的生物标志物，以及一种肝病纤维化的双抗体夹心法ELISA诊断试剂。血清THBS2定量检测，可以对各类肝病的纤维化程度作出快速的辅助诊断，具有重要的临床预后应用价值。

【技术实现步骤摘要】
检测血清THBS2表达的肝病纤维化检测试剂、检测试剂盒和检测方法
本专利技术属于生物医药
更具体地，涉及一种用于肝病纤维化诊断的双抗体夹心ELISA检测方法及试剂
技术介绍
肝病包括酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、急/慢性病毒性肝病、自身免疫性肝病、药物/毒物性肝病、胆汁淤积性肝炎及遗传性肝病等。肝病的重症化倾向常以肝病的反复炎症性过程，随后纤维化的不断进展为表征。肝病纤维化晚期可发展至终末期肝病如肝硬化甚至肝癌。当前对终末期肝病的治疗并不乐观，早期诊断、干预对肝病的治疗及预后尤为关键。当前对肝纤维化的判断通常基于三角度。1)病理检查。肝组织病理活检仍是评价肝病程度的金标准，但属于有创性方法。2)血清学检查。肝纤维化四项如血清III型前胶原氨基端肽(PIIINP)、IV胶原(CIV)、层连蛋白(LN)、透明质酸(HA)已在临床常规开展，但存在特异性、敏感性不足的缺陷。3)影像学检查。影像学技术可用于诊断肝硬化、肝肿瘤，但对慢性肝病存在早期预警程度差、成本较高的缺点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有肝病纤维化诊断技术的缺陷和不足，提供了一种新的肝病纤维化诊断标志物，即血小板反应蛋白2(Thrombospondin2,THBS2)基因。THBS2是凝血酶敏感素家族成员之一，广泛分布于上皮来源组织中的细胞外基质。本专利技术人通过检测正常人和肝病患者血清中THBS2的含量，统计学分析肝病患者THBS2的表达显著增高。对于肝病纤维化显著期患者的检测发现，血清THBS2的表达水平随纤维化分期程度而递增；且肝病纤维化显著期患者较不显著患者THBS2的表达显著上升。因此，THBS2是肝脏纤维化一个较好的检测指标，特别是对于肝病纤维化进展的早期预警和诊断，为该疾病的临床早期诊治找到一种新的生物标记物。本专利技术的第一个目的是提供血清THBS2在作为肝病纤维化诊断标志物方面的应用。本专利技术第二个目的是提供了一种检测THBS2表达的肝病纤维化检测试剂盒，包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。具体的，所述THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体为人THBS2重组单克隆抗体更进一步的，THBS2捕获抗体用于包被酶标板，辣根过氧化物酶标记于THBS2酶标抗体。具体的，所述试剂盒包括THBS2捕获抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的THBS2酶标抗体、THBS2标准品、和辅助试剂组成。更具体的，所述试剂盒包括如下组分：(1)酶标板：在固相96孔酶标板上包被有人THBS2重组单克隆抗体；(2)酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记的人THBS2重组单克隆抗体反应液；(3)显色液；(4)洗涤液；(5)结合物稀释液；(6)终止液。所述试剂盒还包括标准品。优选地，所述试剂盒可作为肝病诊断试剂盒和早期预警诊断试剂盒。本专利技术的第三个目的是提供了诊断肝病纤维化的检测试剂，包括与THBS2特异性结合的抗体。进一步的，所述THBS2特异性抗体为人THBS2重组单克隆抗体。具体的，所述抗体包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。所述包被酶标板的THBS2捕获抗体和HRP标记的THBS2酶标抗体为配对抗体本专利技术还提供了一种血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法，利用上述试剂盒进行双抗体夹心法ELISA检测。优选地，所述的血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法步骤如下：本专利技术还提供了一种血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法，利用上述试剂进行双抗体夹心法ELISA检测。具体的，所述血清THBS2的双抗体夹心法ELISA检测方法步骤如下：S1.包被：THBS2单克隆抗体用PBS包被稀释液(137mMNaCl，2.7mMKCl，8.1mMNa2HPO4，1.5mMKH2PO4，pH7.2-7.4)稀释至5μg/ml，加入96孔板，100μl/孔，4℃放置36小时；S2.封闭：洗涤液(0.05％Tween20-PBS)冲洗96孔板3次，加结合物稀释液(0.1％BSA-PBS)200μl/孔，37℃放置1小时；S3.加待检血清样品：洗涤液冲洗96孔板3次，加待检血清样品(1:40)及结合物稀释液稀释的人THBS2标准蛋白100μl/孔，37℃放置2小时；S4.加酶标抗体：洗涤液冲洗96孔板数次，用结合物稀释液稀释酶标抗体至0.2ug/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置2小时；S5.加酶结合物工作液：洗涤液冲洗96孔板3次，加入96孔板，100μl/孔，37℃放置20分钟；S6.显色：洗涤液冲洗96孔板5次，显色液底物加入96孔板，100μl/孔，37℃显色20分钟，再加终止液，轻轻摇晃均匀；S7.标准曲线：根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量，数据统计出血清THBS2含量。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了一种新的诊断肝病纤维化严重程度的生物标记物，尤其是对于肝病进展的程度，具有特别重要的预警作用和临床应用价值。同时，本专利技术还建立了一种基于双抗体夹心原理的酶联免疫诊断方案，并开发成诊断试剂盒，可以快速、准确地进行THBS2的检测；从而可以对各种肝病的纤维化进展程度作出快速的辅助诊断。附图说明图1THBS2检测的标准曲线。图2正常组与肝病组的THBS2表达量比较。图3肝病患者按照纤维化分期的THBS2表达量。图4肝病非显著纤维化组与显著纤维化组的THBS2表达量比较。图5THBS2的表达量预测肝病纤维化的性能。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定，该领域的技术人员可以根据上述
技术实现思路
对本专利技术做出一些非本质的改进和调整。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。任何与记载内容相似或均等的方法及材料均可应用于本专利技术中。检测血清THBS2表达的肝病纤维化诊断试剂，包括检测THBS2的试剂，具体包括特异性结合THBS2的抗体。更具体的实施方案中，包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。所述捕获抗体和酶标抗体为配对抗体。用于肝病纤维化诊断的基膜聚糖(THBS2)酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒，采用双抗体夹心法，所述试剂盒包括THBS2捕获抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的THBS2酶标抗体、THBS2标准品和辅助试剂组成。在一个优选的方案中，所述包被酶标板的THBS2捕获抗体和HRP标记的THBS2酶标抗体为配对抗体。所述辅助试剂包括显色液、洗涤液、结合物稀释液和终止液。在一个具体的实施方案中，基膜聚糖(THBS2)酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒包括如下组分：(1)酶标板：在固相96孔酶标板上包被有人THBS2重组单克本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测THBS2表达的肝病纤维化检测试剂盒，其特征在于，包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测THBS2表达的肝病纤维化检测试剂盒，其特征在于，包括THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体。


2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述THBS2捕获抗体和用于标记的THBS2酶标抗体为人THBS2重组单克隆抗体。


3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为ELISA试剂盒。


4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：(1)酶标板：在固相96孔酶标板上包被有人THBS2重组单克隆抗体；(2)酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记的人THBS2重组单克隆抗体反应液；(3)显色液；(4)洗涤液；(5)结合物稀释液；(6)终止液。


5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨劲，施军平，陆安倩，
申请(专利权)人：杭州师范大学附属医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33