一种长双歧杆菌诱变菌株H8制造技术

一种长双歧杆菌诱变菌株H8，所述长双歧杆菌诱变菌株H8分类学命名为Bifidobacterium longum，于2019年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18468。本发明专利技术长双歧杆菌诱变菌株H8是以长双岐杆菌6189为出发菌株，采用等离子体诱变处理技术筛选得到的。本发明专利技术诱变菌株H8相比出发菌株，其延滞期大大缩短，生长速率也显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种长双歧杆菌诱变菌株H8
本专利技术涉及微生物制剂，更具体地说，它涉及一种耐氧的长双歧杆菌诱变菌株H8。
技术介绍
长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum），是益生菌的一种，具有调节人体肠道，改善健康功效，取自健康人体肠道，属于双歧杆菌属。双歧杆菌（Bifidobacterium）是1899年由法国学者Tissier从健康母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，末端常常分叉，故名双歧杆菌。双歧杆菌是一种经典的益生菌，其对人体健康的促进作用已得到了广泛的研究证明，常见和常用的菌种有两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌。双歧杆菌在人体肠内发酵后可产生乳酸和醋酸，能提高钙、磷、铁的利用率，具有治疗慢性腹泻、治疗便秘、保护肝脏、防治心血管疾病、改善乳糖消化等作用，其在功能食品及药品中具有巨大的应用价值。人体内的双歧杆菌要在达到一定数量之后才能发挥其益生作用，产品中双歧杆菌在保质期内必须保持在106cfu/mL或106cfu/g以上，才能发挥作用。由于双歧杆菌属于专性厌氧菌，在加工、包装及储存等过程中对氧气尤为敏感，如与溶解氧接触会导致其活性下降，造成菌株死亡。双歧杆菌因缺乏能分解过氧化氢的酶，细胞无法分解代谢所产生的过氧化氢，而过氧化氢对细胞代谢系统中的关键酶有毒害，此外，有氧时，细胞内的某些酶及辅酶因被氧化而失活，也会造成代谢障碍，这都是造成双歧杆菌菌株死亡的原因。如果要实现规模化生产就需要严格控制环境中含氧量，这给生产双歧杆菌的厂家也带来了一定的困难。因此，如何提高双歧杆菌的耐氧性是促进其广泛应用的关键问题。
技术实现思路
为了解决现有长双歧杆菌不耐氧的问题，本专利技术提供了一种诱变耐氧长双歧杆菌菌株H8，其延滞期短，生长速率高。技术方案：本专利技术长双歧杆菌菌株H8，其分类学命名为Bifidobacteriumlongum，于2019年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18468，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术另一个目的还提供了长双歧杆菌诱变菌株H8的诱变方法，其包括以下步骤：（1）将长双岐杆菌出发菌株6189在含有固体培养基的平板上划线，37℃厌氧培养48h，待菌株有明显单菌落后挑单菌落，以1%接种量接种到液体培养基中，37℃厌氧培养，测定其生长曲线，选择对数生长中期的菌株进行诱变培育；（2）将对数生长中期的出发菌株细胞离心收集，用生理盐水重悬调节至OD600为5.0，取细胞悬液平铺于载片上，涂布量10μL/片；（3）用ARTP诱变育种仪，功率设定为120W，气量设定为10SLM，进行诱变处理，等离子体诱变处理时间10~20s；（4）长双岐杆菌出发菌株6189诱变后，凃板，37℃有氧培养，挑其中菌落较大的菌株转接至96孔板培养，测定生长曲线，筛选出其中生长速率最快的菌株。作为优选，所述液体培养基为含肉汁10g，蛋白胨5g，酵母粉3g，D(+)-葡萄糖5g，淀粉1g，NaCl5g，NaAc3g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1.0L，多粘菌素0.02g，pH6.6~7.0。作为优选，所述固体培养基成分为肉汁10g，蛋白胨5g，酵母粉3g，D(+)-葡萄糖5g，淀粉1g，NaCl5g，NaAc3g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，多粘菌素B0.02g，琼脂粉15g，蒸馏水1.0L，pH6.6~7.0。作为优选，所述ARTP诱变育种仪诱变处理时间20s。本专利技术的有益效果本专利技术长双歧杆菌诱变菌株H8具有良好的生长耐氧性能，相比于出发菌株，其生长延滞期缩短，生长速度得到显著提高。附图说明图1为长双歧杆菌出发菌株6189生长曲线；图2为16srDNAPCR结果，左侧为长双岐杆菌出发菌株6189，右侧为长双歧杆菌诱变菌株H8；图3为长双岐杆菌诱变菌株H8与长双歧杆菌出发菌株6189生长曲线比较。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细说明，如无特别说明，本专利技术中所使用的试剂和耗材均为市购获得的常规产品。一、长双岐杆菌出发菌株6189的培养及生长曲线测定将长双岐杆菌出发菌株6189在含有固体培养基的平板上划线，37℃厌氧培养48h，待菌株有明显单菌落后挑单菌落，以1%接种量接种到液体培养基中，37℃厌氧培养，每隔2h取样测定生长情况，绘制生长曲线，如图1所示，菌株生长前期处于延滞期，生长缓慢，直至菌株长到平台期。上述固体培养基成分：肉汁10g，蛋白胨5g，酵母粉3g，D(+)-葡萄糖5g，淀粉1g，NaCl5g，NaAc3g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，多粘菌素B0.02g，琼脂粉15g，蒸馏水1.0L，pH6.6~7.0，121℃湿热灭菌15min。上述液体培养基成分：肉汁10g，蛋白胨5g，酵母粉3g，D(+)-葡萄糖5g，淀粉1g，NaCl5g，NaAc3g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，多粘菌素B0.02g，蒸馏水1.0L，pH6.6~7.0，121℃湿热灭菌15min。二、等离子体诱变条件的选择由图1生长曲线知14~16h为对数生长期，诱变选择培养15h的菌株进行，将生长到15h（OD=1.47）的出发菌株细胞8000rpm，20min离心收集，用生理盐水重悬调节至OD600为5.0，各取10μL细胞悬液平铺于6块载片上，放置2mL无菌EP管准备收集载片。ARTP诱变育种仪（购自无锡源清天木生物科技有限公司），功率设定120W，气量设定10SLM，进行诱变处理。等离子体诱变处理时间分别为0s、10s、20s、30s、45s、60s。将诱变后的菌株稀释10-4涂布100μL，37℃无氧培养48h后对平板菌落数目进行计数并计算致死率，结果如表1所示。表1不同诱变时间致死率处理时间（S）菌落个数致死率（%、）01000+01023876.2204595.5300100450100600100由表1可知，等离子体诱变时间选择处理20s最优，既不能完全使菌株致死，又能产生足够的突变体。三、耐氧菌株的筛选将生长到15h（OD=1.47）的原始菌株细胞离心收集，用生理盐水重悬调节至OD600为5.0，各取10μL生理盐水重悬后的细胞悬液平铺于6块载片上，放置2mL无菌EP管准备收集载片。ARTP诱变育种仪，功率设定120W，气量设定10SLM，进行诱变处理20s后，将诱变后的菌株稀释10-2涂布200μL，共涂板30块，37℃有氧培养。诱变涂板后，培养至每板约100个菌落，挑其中菌落较大的菌株单独培养，转接至96孔板后测定其生长曲线，挑选其中生长速率最快的菌株，命名为H8，于2019年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18468，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。四、菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长双歧杆菌诱变菌株H8，其分类学命名为Bifidobacterium longum，于2019年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18468。/n

【技术特征摘要】
1.一种长双歧杆菌诱变菌株H8，其分类学命名为Bifidobacteriumlongum，于2019年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18468。


2.如权利要求1所述的长双歧杆菌诱变菌株H8的诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将长双岐杆菌出发菌株6189在含有固体培养基的平板上划线，37℃厌氧培养48h，待菌株有明显单菌落后挑单菌落，以1%接种量接种到液体培养基中，37℃厌氧培养，测定其生长曲线，选择对数生长中期的菌株进行诱变培育；
（2）将对数生长中期的出发菌株细胞离心收集，用生理盐水重悬调节至OD600=5.0，取细胞悬液平铺于载片上，涂布量10μL/片；
（3）用ARTP诱变育种仪，功率设定为120W，气量设定为10SLM，进行诱变处理，诱变处理时间10~2...

【专利技术属性】
技术研发人员：史鲁秋，汪昌国，薛虹宇，苏桂珍，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：南京盛德生物科技研究院有限公司，南京美荣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32