【技术实现步骤摘要】
高活性β-半乳糖苷酶的制备
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及高活性β-半乳糖苷酶的制备。
技术介绍
乳糖不耐症是一种乳糖消化不良疾病，主要原因是生物体内缺乏乳糖酶或其活性较低，乳糖不能被乳糖酶水解成单糖，人体无法吸收，我国成年人乳糖吸收不良的发病率高达86.7％。乳糖酶又称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，可将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，乳糖酶的应用领域很广，在医药、乳制品、免疫分析检测、化学合成、生物、环保领域都有应用。目前公认制备乳糖酶比较安全的菌株主要有益生菌、乳酸克鲁维酵母、米曲霉、黑曲霉、脆壁克鲁维酵母。国内外已经对乳糖酶进行了大量的研究工作，但尚未得到广泛应用，主要原因有：1.乳糖酶的单位产量较低；2.市场上的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取纯化工艺复杂，成本高；3.酶的作用温度低、耐热性差，工业生产中容易染杂菌，适用范围窄。本研究主要通过提高乳糖酶的酶活，解决乳糖酶的成本问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种β-半乳糖苷酶催化活性的方法，使得β-半...
【技术保护点】
1.高活性β-半乳糖苷酶的制备，其特征在于，所述酶基因序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第1983位，由原来的A分别突变为T，构建方法包括以下步骤：/n1)从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F：5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加2...
【技术特征摘要】
1.高活性β-半乳糖苷酶的制备，其特征在于，所述酶基因序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第1983位，由原来的A分别突变为T，构建方法包括以下步骤：
1)从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F：5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2)质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3)易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA200ng，TaqDNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn2+，0.5U/μl的TaqDNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliBL21；
4)突变文库的高通量筛选
将步骤3得到的转化E.coliBL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/mL)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/...
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