高活性β-半乳糖苷酶的制备制造技术

本发明专利技术涉及高活性β‑半乳糖苷酶的制备，酶基因序列(β‑galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第1983位上发生突变，由原来的A分别突变为T，其有益效果在于，获得的突变β‑半乳糖苷酶具有更高的酶活。

【技术实现步骤摘要】
高活性β-半乳糖苷酶的制备
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及高活性β-半乳糖苷酶的制备。
技术介绍
乳糖不耐症是一种乳糖消化不良疾病，主要原因是生物体内缺乏乳糖酶或其活性较低，乳糖不能被乳糖酶水解成单糖，人体无法吸收，我国成年人乳糖吸收不良的发病率高达86.7％。乳糖酶又称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，可将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，乳糖酶的应用领域很广，在医药、乳制品、免疫分析检测、化学合成、生物、环保领域都有应用。目前公认制备乳糖酶比较安全的菌株主要有益生菌、乳酸克鲁维酵母、米曲霉、黑曲霉、脆壁克鲁维酵母。国内外已经对乳糖酶进行了大量的研究工作，但尚未得到广泛应用，主要原因有：1.乳糖酶的单位产量较低；2.市场上的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取纯化工艺复杂，成本高；3.酶的作用温度低、耐热性差，工业生产中容易染杂菌，适用范围窄。本研究主要通过提高乳糖酶的酶活，解决乳糖酶的成本问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种β-半乳糖苷酶催化活性的方法，使得β-半乳糖苷酶的酶活性有很大的提高，其具有更高的应用潜力和经济价值。本专利技术的制备过程如下：1.从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F：5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；2.质粒DNA的提取将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；3.易错PCR扩增与突变文库的构建以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA200ng，TaqDNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn2+，0.5U/μl的TaqDNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliBL21；4.突变文库的高通量筛选将步骤3得到的转化E.coliBL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/mL)，37℃温育12h，将平板上菌落全部刮取，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的100mLLB培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经XbaⅠ酶切后电击转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，待MD平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有X-gal的MM培养基上，使X-gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入YPD培养基500μL、2％接种量，于28℃、200r/min培养48h，离心收集菌体以500μLBMMY培养基重悬菌体，28℃、200r/min培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；5.酶蛋白纯化配制AKTA使用的缓冲液，其中A液：20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH7.5)，B液：1mol/L氯化钠溶液(20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH7.5)，以5倍柱床体积的A液平衡柱子后，粗酶液经A液流入captorQ(1mL)阴离子柱中，通过B液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的B液洗脱杂蛋白，再以5％B液洗脱目的蛋白；6.粗酶液中蛋白含量的测定标准曲线绘制：以牛血清蛋白(BSA)为标准品，配置10mg/mLBSA母液，稀释为以下几个梯度：10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL，取不同浓度BSA溶液或超纯水40μL，加入5倍稀释后的Bio-Rad考马斯亮蓝蛋白染液260μL，震荡混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线，取粗酶液或纯化后的酶液40μL，加入稀释后染液260μL，混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中于595nm下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度；7.酶活及比活力测定配制不同浓度对硝基苯酚溶液(浓度分别为0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L和0.1mmol/L)，定容至10ml，各取2ml，加入2ml1mol/LNa2CO3溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚-光密度标准曲线；将200μL稀释的酶液加入到800μL2.5g/L经预热的ONPG(pH6.5，1mM磷酸钾缓冲液)溶液中，在给定温度下反应10min，加入1mL10％Na2CO3溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液，假设标准曲线为Y＝aX+b；E:酶活，单位U/mlt:反应时间N:酶液稀释倍数V2：反应终体积V1：酶液添加量8.将比活最高的突变子，送生物公司测序。本专利技术的有益效果是：获得的突变β-β-半乳糖苷酶具有更高的酶活。附图说明图1易本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高活性β-半乳糖苷酶的制备，其特征在于，所述酶基因序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第1983位，由原来的A分别突变为T，构建方法包括以下步骤：/n1)从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F：5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；/n2)质粒DNA的提取/n将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Am p(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；/n3)易错PCR扩增与突变文库的构建/n以步骤2获得的质粒为模板，用Not Ⅰ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa TaqBuffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn...

【技术特征摘要】
1.高活性β-半乳糖苷酶的制备，其特征在于，所述酶基因序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第1983位，由原来的A分别突变为T，构建方法包括以下步骤：
1)从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F：5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2)质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3)易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA200ng，TaqDNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn2+，0.5U/μl的TaqDNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliBL21；
4)突变文库的高通量筛选
将步骤3得到的转化E.coliBL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/mL)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：马金佑，
申请(专利权)人：马金佑，
类型：发明
国别省市：广东;44