β-半乳糖苷酶融合蛋白及其制备方法与用途技术

本发明专利技术提供了一种β‑半乳糖苷酶融合蛋白及其制备方法与用途，通过使用柔性肽接头连接两个β‑半乳糖苷酶催化亚基刚性单元，使其在大肠杆菌原核系统中成功高效地异源表达出有活性的重组蛋白；本发明专利技术在二聚体间插入Linker的方法基于基因克隆、重组手段，具有操作便捷、经济成本低且重复性高等优点。

【技术实现步骤摘要】
β-半乳糖苷酶融合蛋白及其制备方法与用途
本专利技术具体涉及一种β-半乳糖苷酶融合蛋白及其制备方法与用途。技术背景β-半乳糖苷酶，常简称为乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。1889年，荷兰生物学家第一次报道了β-半乳糖苷酶可水解乳糖，β-半乳糖苷酶的最初应用也是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。利用各种技术手段研究β-半乳糖苷酶对乳中乳糖的水解作用，具有很强的现实意义。鉴于Lactobacillusbrevis源的β-半乳糖苷酶为由两个大小不一的亚基组成的异型二聚体，本申请以氨基酸序列组成的柔性肽接头以连接Lactobacillusbrevis源β-半乳糖苷酶的两个蛋白亚基，基于克隆、基因重组等程序，对表达的重组蛋白进行β-半乳糖苷酶活性评估和应用。
技术实现思路
基于现有技术的状况，本专利技术的目的是提供一种β-半乳糖苷酶融合蛋白及其制备方法与用途；通过柔性氨基酸肽接头连接二聚体使其在大肠杆菌原核系统中异源表达，本专利技术建立了氨基酸柔性肽链(柔性肽接头)插入二聚体之间用以连接两个亚基的方法。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：一种β-半乳糖苷酶融合蛋白，所述融合蛋白通过使用柔性肽接头连接两个β-半乳糖苷酶催化亚基刚性单元。作为本申请的优选技术方案，所述β-半乳糖苷酶催化亚基刚性单元为同型亚基或异型亚基。作为本申请的优选技术方案，所述β-半乳糖苷酶催化亚基来源于短乳酸杆菌Lactobacillusbrevis。作为本申请的优选技术方案，所述柔性肽接头为由几个氨基酸相互连接形成的含有多个肽键的一条柔性链状结构，用以提高β-半乳糖苷酶酶活力。优选的，本专利技术提供了一种融合蛋白，该融合蛋白通过柔性肽接头连接两个β-半乳糖苷酶催化亚基刚性单元；所述两个亚基单元包含：1.两个蛋白亚基为异型亚基，其编码的基因长度不一，蛋白结构不同。2.两个亚基单元来源于短乳酸杆菌Lactobacillusbrevis。3.两个亚基单元具有β-半乳糖苷酶的活性，可催化β-1,4糖苷键相连的非还原端半乳糖基团水解。作为本申请的优选技术方案，所述柔性肽接头选自甘氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或丙氨酸中的一种多种。作为本申请的优选技术方案，所述柔性肽的分子式含有(GxSy)n的重复序列，其中，x、y、n为大于等于1的整数。更优选的，所述柔性肽接头选自以下组：Linker1：GSHM；Linker2：GSGSGHM；Linker3：GSGGSGGHM；Linker4：GSGGGSGHM；Linker5：GSGGGGSHM；Linker6：GSGGGSGGGSHM。更优选的，所述柔性肽接头选自：Linker4：GSGGGSGHM；Linker5：GSGGGGSHM；Linker6：GSGGGSGGGSHM。本专利技术还提供了上述柔性肽接头连接的异二聚体即融合蛋白的DNA序列，包括限制性酶切位点基因序列。本专利技术还提供了上述柔性肽接头连接的异二聚体(即β-半乳糖苷酶融合蛋白)的氨基酸测序序列，如SEQIDNO：10-15所示；其中，柔性肽接头为Linker1时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示；柔性肽接头为Linker2时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：11所示；柔性肽接头为Linker3时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：12所示；柔性肽接头为Linker4时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：13所示；柔性肽接头为Linker5时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：14所示；柔性肽接头为Linker6时，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：15所示。一种β-半乳糖苷酶融合蛋白的制备方法，基于分子生物学通用方法，使用限制性内切酶将柔性肽接头插入在异二聚体之间构建表达载体进行原核表达；所述方法为包括：引物设计、基因克隆以及蛋白诱导表达等。优选的，所述制备方法如下：(1)设计含有酶切位点的DNA序列，两个亚基的N端、C端携带不同的酶切位点基因序列，对肽链部分的一端或两端设计相应的酶切位点；(2)合成引物序列，以单亚基的DNA序列为模板，引物部分包括酶切位点、柔性肽接头的DNA序列、以及可与模板互补的DNA片段；(3)使用引物进行PCR扩增，在原亚基模板上扩增出携带有柔性肽接头的DNA序列的长片段；(4)对扩增产物进行酶切酶连，通过酶切位点分别连接两个亚基的N端和C端，在亚基之间插入柔性肽接头；所述柔性肽接头为通过相关酶切位点酶切连接、翻译后形成的氨基酸；(5)构建重组载体并在原核生物中表达。更优选的，所述制备方法包括如下步骤：(1)针对异二聚体(由大亚基LbGalA和小亚基LbGalB组成)中的小亚基LbGalB，设计PCR的引物，其中正向引物保持一致，均为LbGalB-FW：5'-aaaccatggaccatcatcatcatcatcataacaccaccaaactgaacgt-3'，SEQIDNO：1；反向引物如下：GSHM：5'-aaacatatgactaccaaccggggtcgg-3'，SEQIDNO：2；GSGSGHM：5'-aaacatatgaccactaccactaaccggggtcgg-3'，SEQIDNO：3；GSGGSGGHM：5'-aaacatatgaccaccactaccaccactaaccggggtcgg-3'，SEQIDNO：4；GSGGGSGHM：5'-aaacatatgaccactaccaccaccactaaccggggtcgg-3'，SEQIDNO：5；GSGGGGSHM：5'-aaacatatgactaccaccaccaccactaaccggggtcgg-3'，SEQIDNO：6；GSGGGSGGGSHM：5'-aaacatatgactaccaccaccactaccaccaccactaaccggggtcgg-3'，SEQIDNO：7；(2)据步骤(1)的设计，以BamHI和NdeI限制性核酸内切酶切开LbGalB和LbGalA之间的片段，将柔性肽接头的DNA序列加入LbGalB和LbGalA之间；(3)再利用NcoI/XhoI同步酶切步骤(2)得到的目的基因、表达载体，并使用T4连接酶酶连，构建表达载体；(3)使用大肠杆菌表达系统进行诱导表达，该大肠杆菌已敲除LacZ-基因以消除菌株本身表达的β-半乳糖苷酶影响。对表达的的重组蛋白(融合蛋白)进行β-半乳糖苷酶活性评估，方法如下：表达的蛋白稀释100倍，利用释放出pNP的量借助酶标仪在紫外分光光度计405nm处有吸收值，其值大小与酶活力呈正相关。本专利技术还提供了一种β-半乳糖苷酶融本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白通过使用柔性肽接头连接两个β-半乳糖苷酶催化亚基刚性单元。/n

【技术特征摘要】
1.一种β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白通过使用柔性肽接头连接两个β-半乳糖苷酶催化亚基刚性单元。


2.根据权利要求1所述的β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶催化亚基刚性单元为同型亚基或异型亚基。


3.根据权利要求2所述的β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶催化亚基来源于短乳酸杆菌Lactobacillusbrevis。


4.根据权利要求1所述的β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头为由几个氨基酸相互连接形成的含有多个肽键的一条柔性链状结构。


5.根据权利要求4所述的β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头选自甘氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或丙氨酸中的一种或多种。


6.如权利要求4所述的β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头的分子式含有(GxSy)n的重复序列，其中，x、y、n为大于等于1的整数。


7.如权利要求6所述的β-半乳糖苷酶融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头选自以下组：
Linker1：GSHM；
Linker2：GSGSGHM；

【专利技术属性】
技术研发人员：韩媛媛，刘丽，约瑟夫·弗戈迈尔，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32