一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种β‑半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用，所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本发明专利技术构建的重组大肠杆菌BL21/pET‑28a(+)‑βgal所产的β‑半乳糖苷酶为酶源进行生物催化反应，可将乳糖转化为低聚半乳糖，其中低聚半乳糖粗品中低聚半乳糖质量浓度为40～50％。

A \u03b2 - galactosidase, gene, engineering bacterium and its application

【技术实现步骤摘要】
一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用
本专利技术涉及一种β-半乳糖苷酶，特别涉及一种来源于产酸克雷伯菌(KlebsiellaoxytocaZJUH1705)菌株的β-半乳糖苷酶基因、酶、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备低聚半乳糖中的应用。
技术介绍
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，E.C.3.2.1.23)广泛存在于动物、植物及微生物中。β-半乳糖苷酶可催化转化乳糖为低聚半乳糖，低聚半乳糖是一种功能性低聚糖，广泛应用于婴幼儿配方食品，烘焙食品，动物饲料等领域。目前已有不同来源的β-半乳糖苷酶基因分别被克隆和测序，并且实现了在不同宿主中的表达。然而野生型β-半乳糖苷酶分离困难，酶活较低，限制了其大规模的制备及应用，因此，构建表达活性高的β-半乳糖苷酶基因工程菌具有实际的应用意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种来源于产酸克雷伯菌(KlebsiellaoxytocaZJUH1705)菌株的β-半乳糖苷酶、编码基因、重组表达载体、基因工程菌，及其在制备低聚半乳糖中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJUH1705的β-半乳糖苷酶基因，所述基因具有与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列95％以上同源性，优选所述β-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，所述基因编码酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术所述产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJUH1705保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2017448，保藏日期：2017年8月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；已在中国专利技术专利CN107904189A中公开。本专利技术SEQIDNO.1所示序列由如下方法获得：利用PCR技术，在引物1(CGCGGATCCATGCAACAACACGAC)、引物2(CCGCTCGAGTTATTGGAAATGAATCGTTAAC)的作用下，以来源于产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJUH1705菌株的总基因组DNA为模板，克隆得到约3100bp的β-半乳糖苷酶基因片段。将该片段连接到pET-28a(+)载体上获得重组表达质粒pET-28a(+)-βgal。对重组质粒进行测序，利用软件对测序结果进行分析，结果表明该序列含有一个长为3108bp的开放阅读框，该基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。任何对SEQIDNO.1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有99％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还涉及一种含有所述β-半乳糖苷酶基因的重组载体及一种由所述重组载体构建的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌构建方法为：将含有目的基因的重组表达载体pET-28a(+)-βgal转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET28a(+)-βgal的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal，即所述重组基因工程菌。本专利技术还涉及一种所述β-半乳糖苷酶基因在构建β-半乳糖苷酶中的应用，所述应用为：构建含有所述β-半乳糖苷酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，从培养液中分离得到含有重组β-半乳糖苷酶的菌体细胞。本专利技术还提供一种所述β-半乳糖苷酶在制备低聚半乳糖中的应用，所述的应用为：以含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液和底物乳糖构成转化体系，在20～40℃、100～300rpm条件下振荡反应30～60h，反应结束后，煮沸3min灭活，即得低聚半乳糖粗品。所述酶源的用量以底物质量计为1～4U/g，酶液酶活力为10-15U/mL(优选13.41U/mL)，所述缓冲液体积用量以底物重量计为1-10mL/g(优选1.5-5mL/g)。进一步，优选反应条件为40℃、200rpm反应48h。优选缓冲液为pH7.0、0.05M磷酸缓冲液。进一步，所述酶源按如下方法制备：(1)湿菌体的制备：将含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，20～37℃、100～200rpm振荡培养6～12h(优选37℃、200rpm振荡培养12h)，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD600达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1mM(优选1mM)的IPTG，20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h(优选28℃、200rpm诱导培养12h)，将所得培养液离心，收集湿菌体；(2)酶液的制备：将步骤(1)湿菌体加50mM、pH7.5的磷酸缓冲液中进行超声波破碎，超声处理条件为：超声功率200W、超声处理1s后，间歇2s，反复处理共30min，破碎后样品经10000rpm、4℃离心10min，所得上清液即为粗酶液；将粗酶液上样于用结合缓冲液平衡好的Ni柱，再次平衡后以洗脱缓冲液洗脱，收集含有酶活的洗脱液，所得洗脱液经透析袋透析后取截留液即为所述酶源；所述结合缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5MNaCl，20-40mM咪唑，溶剂为水，优选20mM磷酸钠，0.5MNaCl，40mM咪唑，溶剂为水；所述洗脱缓冲液组成：20mM磷酸钠，0.5MNaCl，300-500mM咪唑，溶剂为水，优选20mM磷酸钠，0.5MNaCl，0.5M咪唑，溶剂为水。所述上样和洗脱流速均为1mL/min。所述透析袋截留分子量10KDa。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一种来源于产酸克雷伯菌(KlebsiellaoxytocaZJUH1705)菌株的β-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列，并将该基因与表达载体连接，构建得到含该基因的表达重组质粒pET-28a(+)-βgal，转化至大肠杆菌BL21中，获得含有表达重组质粒pET-28a(+)-βgal的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal；利用所述发酵的重组质粒pET-28a(+)-βgal的重组大肠杆菌细胞，经过简单的超声破碎，离心，Ni柱纯化步骤即可获得纯化的β-半乳糖苷酶酶源，可应用本专利技术构建的重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-βgal所产的β-半乳糖苷酶为酶源进行生物催化反应，可将乳糖转化为低聚半乳糖，其中低聚半乳糖粗品中低聚半乳糖质量浓度为40～50％。相较于已报道的中国专利(CN106479925B)，本专利技术使用了不同种的菌体(KlebsiellaoxytocaZJUH1705vs.Klebsiellamichiganensis)，实现了该酶的异源表达。相较于日本专利(JP3556704B2)，本专利技术克隆表达的β-半乳糖苷酶与其分离得到的酶不同，表现为酶源获得方法不同(本专利技术，克隆表达；日本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)ZJUH1705的β-半乳糖苷酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)ZJUH1705的β-半乳糖苷酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。


2.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。


3.一种权利要求1所述β-半乳糖苷酶在催化乳糖制备低聚半乳糖中的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液和乳糖构成转化体系，在20～40℃、100～300rpm条件下振荡反应30～60h，反应结束后，即得低聚半乳糖粗品。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酶源的用量以底物质量计为1～4U/g，所述缓冲液体积加入量以乳糖重量计为1-10mL/g。


6.如权利要求4所述的应用，其特征在于反应条件为40℃、200rpm反应48h。


7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH7.0、0.05M磷酸缓冲液。


8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：(1)湿菌体的制备：将含β-半乳糖苷酶基因的重组工程菌接种至含50...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金，竺胜权，杜美妮，赵琳琪，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33