一种β-琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种β‑琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用。该酶具有新颖的氨基酸序列及良好的酶学性质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明专利技术开发了一种以β‑琼脂糖酶Aga16_WA检测琼脂含量的试剂盒：包括试剂A、试剂B、试剂C及校准品，其中试剂A包含β‑琼脂糖酶Aga16_WA与稳定剂。该试剂盒线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。

A \u03b2 - agarase and its application in agar quantitative detection

【技术实现步骤摘要】
一种β-琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用
本专利技术涉及生物技术及生化检测
，尤其涉及一种β-琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用。
技术介绍
琼脂是一类从红藻类植物中提取的亲水性胶体，主要由β-d-半乳糖和3,6-内醚-l-半乳糖通过β-1,4糖苷键与α-1,3糖苷键交联而成，是目前世界上用途最广泛的海藻胶之一，因其具有良好的凝胶性与食用安全性，被广泛的应用于食品工业、医药工业、日用化工、生物工程等许多方面。在食品工业中，琼脂作为一种重要的食品添加剂，可应用于果冻、乳制品、冰淇淋、罐头及肉制品等食品中，在医学领域，琼脂可作为慢性便秘、高胆固醇等病症的直接药用剂。琼脂作为一种膳食纤维，适当摄入会对人体有很大益处，但摄入过多或过少都不利于人体的健康，摄入量过多会造成人体的热量摄入太少，并且琼脂的网状结构对矿物质离子具有很强的吸附作用，会阻止人体对矿物质的吸收，摄入量过少可能会导致高血糖、高血脂及便秘等健康问题。因此，准确检测琼脂的含量对于人们生活水平的提高以及自身健康的保持具有重要意义。目前，常用的琼脂定量检测方法是苯酚-硫酸法和高效液相色谱法等。苯酚-硫酸法灵敏度高，且不需贵重仪器，但准确性和重现性受试验条件影响较大，且费时费事、样品和试剂消耗较多。高效液相色谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。琼脂糖酶是一类可特异性降解琼脂糖的水解酶，根据酶解位置的差异，可分为α-琼脂糖酶与β-琼脂糖酶，分别降解琼脂糖的α-1,3糖苷键与β-1,4糖苷键。对羟基苯甲酰肼(pHBH)是一种芳香族酰肼类化合物，在强碱性条件下能与β-二酮类化合物生成黄色产物。有研究表明，pHBH在高温及碱性条件下，可与葡萄糖等还原糖反应产生相似的黄色物质，反应后颜色深浅与还原糖浓度成正比，且该反应的灵敏度较高。所以找到一种具有高度特异性的β-琼脂糖酶，对于琼脂的定量检测具有重大的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是常用的琼脂定量检测方法是苯酚-硫酸法和高效液相色谱法，这两种方法分别具有准确性差和操作繁琐、费时费力的问题。为解决上述问题，本专利技术提供一种新型β-琼脂糖酶Aga16_Wa，该酶与其他已知酶的序列相似度最高为69％(最相近序列为CatenovulumagarivoransYM01所产的beta-agarase)。该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存6个月，在25℃的温度范围内放置10天后仍能保持80％的活力。而且具有良好的反应特异性，对于琼脂具有高活力，但对于其他海洋多糖，如褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。综上，β-琼脂糖酶Aga16_Wa具有良好的应用潜力，特别是应用于检测琼脂含量，具有操作简便、准确度高、稳定性好的特点。为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种β-琼脂糖酶，为β-琼脂糖酶Aga16_Wa，其氨基酸序列为SEQIDNO.1。SEQIDNO.1：MRRVNFWKKTSVLLFSVFIAVGSCASDSADFIPPPAEEPKEEEPKVEVKVIDVTKADVNYPTFVSFDDNTPEGMVWEKVEALSDEFETWNSDKWTKTNWNYGGTPVNMLNKNSGVTDGNLWIKATLDSTSEDQWFETSRVRSKTSIKFPMYTECSIKTAHISAFNTFWLNNGNSNDRDEIDIIENNSNPSAEATNSFDLDAYPWQMNSQYFIVKDGVTERAKGNSSNKDLSEGNTLRGVKWNEAYHVVGAWWKDAYTVQFYLDGEPSGKVTTKQPFTLEQFLIWDLWTQDSAWVGGLPKKEELLDDTVNTMRVDWVRTWKLVSK该酶与其他已知酶的序列相似度最高为69％(最相近序列为CatenovulumagarivoransYM01所产的beta-agarase)。利用MEGA6将Aga16_Wa与GH16家族已研究过的β-琼脂糖酶序列构建系统发育树，结果如图3所示：可以看出β-琼脂糖酶Aga16_Wa处于GH16家族β-琼脂糖酶的系统发育树中。因此，Aga16_Wa是β-琼脂糖酶GH16家族的一个新成员。将β-琼脂糖酶Aga16_Wa氨基酸序列进行Blast分析并利用ClustalX2将Aga16_Wa与GH16家族已知的具有晶体结构的4条β-琼脂糖酶序列进行多序列比对，结果如图4所示：这4个β-琼脂糖酶分别是来源于ZobelliagalactanivoransDsijT的AgaA_Zg(GenbankCAZ98338.1)，来源于MicrobulbiferthermotoleransJAMB-A94的AgaA_Mt(GenbankBAD29947.1)，来源于ZobelliagalactanivoransDsijT的AgaB_Zg(GenbankCAZ97711.1)与来源于ZobelliagalactanivoransDsijT的AgaD_Zg(GenbankCAZ98378.1)。由图4可知，Aga16_Wa除在关键催化位点严格保守外，在其他位点均显示不同程度的特异性，且Blast证实Aga16_Wa与CatenovulumagarivoransYM01所产的beta-agarase序列相比，仅具有69％的最高相似度，表明Aga16_Wa是GH16家族中一种新颖的β-琼脂糖酶。上述β-琼脂糖酶Aga16_Wa的最适反应温度为40℃，最适反应pH值为7.0，在4℃下可至少稳定贮存6个月，在25℃的温度范围内放置10天后仍能保持80％的活力，且在pH5.5-9.5的pH值范围内保持稳定，酶动力学常数Km为0.08mM，Kcat为1541.67s-1，Kcat/Km为20.56M-1s-1。可得知，相较于其他琼脂糖酶，本专利技术的β-琼脂糖酶Aga16_Wa酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，底物结合特异性强、酶解速率快，是用于定量检测琼脂含量的理想的酶。本专利技术中编码上述β-琼脂糖酶Aga16_Wa的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.2及可翻译出SEQIDNO.1的所有基因。SEQIDNO.2：ATGAGGAGAGTTAATTTTTGGAAAAAAACATCAGTATTGTTGTTTTCTGTATTTATAGCAGTAGGAAGTTGTGCAAGTGATTCTGCAGATTTTATACCGCCACCTGCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGAGCCTAAAGTAGAGGTTAAAGTAATAGATGTAACTAAGGCAGATGTAAATTATCCAACATTTGTGTCTTTTGATGATAACACACCTGAAGGAATGGTTTGGGAAAAGGTAGAGGCTTTGTCTGATGAGTTTGAAACTTGGAATAGTGATAAATGGACAAAAACAAATTGGAATTACGGAGGTACTCCTGTAAATATGCTAAATAAAAATTCAGGAGTAACAGATGGAAATTTGTGGATAAAAGCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β-琼脂糖酶，其特征在于：为β-琼脂糖酶Aga16_WA，其氨基酸序列为SEQ IDNO.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种β-琼脂糖酶，其特征在于：为β-琼脂糖酶Aga16_WA，其氨基酸序列为SEQIDNO.1。


2.如权利要求1所述β-琼脂糖酶，其特征在于：所述β-琼脂糖酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH值为7.0；在4℃下可至少稳定贮存6个月，在25℃的温度范围内放置10天后仍能保持80％的活力，且在pH5.5-9.5的pH值范围内保持稳定；酶动力学常数Km为0.08mM，Kcat为1541.67s-1，Kcat/Km为20.56M-1s-1。


3.权利要求1中所述β-琼脂糖酶的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.2及可翻译出SEQIDNO.1的所有基因。


4.权利要求1中所述的β-琼脂糖酶的制备与纯化方法。


5.如权利要求1所述的β-琼脂糖酶在琼脂定量检测中的应用。


6.一种酶法检测琼脂含量的试剂盒，其特征在于：包括试剂A、试剂B、试剂C和校准品，其中试剂A包含β-琼脂糖酶Aga16_WA与稳定剂，试剂B为显色剂，试剂C为NaOH溶液，校准品为琼脂糖标准溶液。


7.如权利要求6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：常耀光，陈广宁，薛长湖，申晶晶，张玉莹，石菲菲，薛勇，张恬恬，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37