一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用。本发明专利技术的乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供的乳糖酶AoGAL在原有乳糖酶的基础上通过人工定向改造而来，具有显著提高的温度稳定性和对高温的耐受性。

A thermostable acid lactase and its gene, strain and Application

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性酸性乳糖酶及基因与菌株和应用
本专利技术属于基因工程
，更具体地，涉及一种热稳定性酸性乳糖酶及编码基因、重组表达载体、重组表达菌株，以及它们的制备方法和应用。
技术介绍
乳糖酶(E.C.3.2.1.23)可特异性地水解乳糖和其它低聚糖和二糖中的β(1-4)半乳糖苷键的水解。在食品领域，乳糖酶主要用来使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。对于内源性乳糖酶功能弱的人群和乳糖不耐受的婴幼儿和成人等人群，在乳品中添加乳糖酶或者口服乳糖酶可以有效地消除乳糖的影响。另一方面，在乳品工业，乳糖酶可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的、溶解度较大的单糖；使冰淇淋、浓缩乳、淡炼乳中乳糖结晶析出的可能性降低，同时增加甜度。随着人们生活水平的日益提高，对牛奶及各种乳制品的需求也逐步增高，但是随之也产生了乳糖不耐受的问题，而消化补充外源性乳糖酶则是缓解乳糖不耐受症状的重要解决办法。在另一领域，乳糖酶能催化β-D-半乳糖苷和α-L-阿拉伯糖苷水解。因此，在饲料中添加乳糖酶，不仅可以水解乳糖，解决乳猪的乳糖不耐受性，同进可以降饲料中的抗营养因子，提高饲料的营养效价。乳糖酶主要来源于细菌、霉菌、酵母等微生物。通常，来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的乳糖酶的最适pH为7.0～7.5之间；来源酵母菌如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)的最适pH为6.0～7.0之间；来源于霉菌如黑曲霉(Aspergillusniger)的乳糖酶呈现为酸性偏好性，其最适pH在5.0左右。不同来源的乳糖酶由于其最适pH不同，因而各自的用途不同。来源于黑曲霉的乳糖酶由于其酸性的特性，在乳制品加工如在乳清的加工中去除乳糖、作为口服剂，或在饲料中添加消除乳猪对乳糖不耐受性以及消除其它抗营养因子等领域具有广泛的用途。乳糖酶的最适温度范围为37～50℃。但是为了扩大乳糖酶的应用领域，特别是在食品、饲料、动物营养等包含高温加工工艺的领域的应用，乳糖酶的热稳定性和高温耐受性需要进一步加强。乳糖酶的高产菌株是实现乳糖酶的工业应用的前提。目前适用于热稳定性好、酸性的乳糖酶较缺乏。传统的乳糖酶因其表达量低而使得催化效率不高，经济性不好，且热稳定性和耐温性较差、要求反应条件苛刻，并不适用大规模的在高温、酸性环境中应用。毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，它具高密度发酵工艺成熟、生产技术配套等优点，是乳糖酶工业化生产的理想菌株。然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性等因素的影响，来源于曲霉的乳糖酶往往不会高效表达。因此，对异源基因的密码子依据毕赤酵母的偏好性进行优化是提高其产量的有效途径。因此，需要对乳糖酶进行改造来提高酶对温度的稳定性，通过密码子优化等手段提高乳糖酶的表达水平，降低生产和使用成本。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种热稳定性的酸性乳糖酶及基因、重组表达载体、重组表达菌株、乳糖酶制备方法，旨在提高为乳糖酶的产业化及应用奠定基础。为了实现上述目的，本专利技术提供一种热稳定性酸性乳糖酶AoGAL，所述乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术的乳糖酶AoGAL的适宜温度为60℃，最适pH为5.5。本专利技术第二方面提供一种乳糖酶基因aogal，用于编码所述的乳糖酶AoGAL，具体地，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列与SEQIDNO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性。优选地，所述乳糖酶基因aogal含有SEQIDNO：2所示的碱基序列即可实现本专利技术的效果。最优选地，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列如SEQIDNO：2所示。根据本专利技术，所述乳糖酶基因aogal和乳糖酶AoGAL由来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的乳糖酶GAL(GenBank登录号：KF857462)经人工定向改造而来。原始乳糖酶基因gal的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述乳糖酶GAL的氨基酸序列如SEQIDNO：3所述。乳糖酶的人工设计如下所述：将乳糖酶基因第166位苯丙氨酸突变为酪氨酸(F166Y)，第249位苏氨酸突变为赖氨酸(T249K)，第296位亮氨酸突变为异亮氨酸(L296I)，第337位丝氨酸突变为苏氨酸(S337T)，第671位甘氨酸突变为天冬氨酸(G671D)，第771位天冬氨酸突变为脯氨酸(D771P)，第774位甲硫氨酸突变为丝氨酸(M774S)，第811位谷氨酸突变为天冬酰胺(E811N)。重新设计的氨基酸所述可采用本领域常规的各种方法实现，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。本专利技术提供了一种重组表达载体，其包括上述乳糖酶基因aogal，还可包括其他功能单元。在乳糖酶AoGAL的氨基酸序列和乳糖酶基因aogal的碱基序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的重组表达载体以及其他功能单元，例如，毕赤酵母表达载体。根据本专利技术一种具体实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括以下步骤：将乳糖酶基因aogal分别用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，获得具有粘性末端的乳糖酶基因aogal片段；将毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，获得具有粘性末端的载体pPICZαA片段；将所述具有粘性末端的乳糖酶基因aogal片段和所述具有粘性末端的载体pPICZαA片段通过T4DNA连接酶连接，获得pPIC-aogal重组表达质粒。除载体pPICZαA外，在本专利技术其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母表达载体。本专利技术提供一种重组表达菌株，该菌株含有aogal基因，其表达产物为上述乳糖酶AoGAL。通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞，例如动物细胞等。优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。根据本专利技术一种具体实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将pPIC-aogal重组表达质粒通过限制性内切酶(如BglII限制性内切酶)线性化；将线性化的pPIC-aogal导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。可选地，通过电转化将重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本专利技术的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母X-33，当然，在本专利技术其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。本专利技术对所述重组表达菌株的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。在乳糖酶AoGaL的氨基酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够获得合适的重组表达菌株。本专利技术中，重组表达菌株制备乳糖酶的方法可以采用本领域常规的方法。根据本专利技术一种具体实施方式，生产乳糖酶的方法包括：挑取重组表达菌株至培养基中培养约24小时，并收获菌体；将菌体转入新鲜的培养基中，每24小时加入约1％的甲醇，诱导乳糖酶AoGAL的表达。诱导表达约96小时后，离心收集上清液，获得含乳糖酶AoGAL的溶液。在一些实施方式中，也可以通过其它方式进行培养，并将发酵上清液视为乳糖酶产物。本专利技术提供一种采用乳糖酶AoGAL水解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热稳定性酸性乳糖酶AoGAL，其特征在于，所述乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性酸性乳糖酶AoGAL，其特征在于，所述乳糖酶AoGAL的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种乳糖酶基因aogal，用于编码权利要求1所述的乳糖酶，其特征在于，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列与SEQIDNO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性，优选地，所述乳糖酶基因aogal的碱基序列如SEQIDNO：2所示。


3.权利要求2所述的乳糖酶基因aogal的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：通过定点突变的方法将原始乳糖酶基因第166位苯丙氨酸突变为酪氨酸，第249位苏氨酸突变为赖氨酸，第296位亮氨酸突变为异亮氨酸，第337位丝氨酸突变为苏氨酸，第671位甘氨酸突变为天冬氨酸，第771位天冬氨酸突变为脯氨酸，第774位甲硫氨酸突变为丝氨酸，第811位谷氨酸突变为天冬酰胺。


4.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的乳糖酶基因aogal。


5.权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将乳糖酶基因aogal分别用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切，获得具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨江科，成静，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42