一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种沙质微泡菌β‑半乳糖苷酶及其编码基因与应用。本发明专利技术提供了一种沙质微泡菌β‑半乳糖苷酶，为序列表的序列2所示的蛋白质。本发明专利技术提供的沙质微泡菌β‑半乳糖苷酶酶学性质优异，对天然底物乳糖的比酶活为38.69U/mg。同时可高效水解乳糖，冷藏温度4℃下以1U/mL加酶量，反应36h后，水解牛奶中80％以上的乳糖，反应48h后，牛奶中90％以上的乳糖被水解，反应72h后，全部水解牛奶中乳糖。另外，反应84h后，水解5％(w/v)的乳清溶液中90％以上的乳糖。本发明专利技术所提供的蛋白质对于食品工业中低乳糖或无乳糖乳制品的生产，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用。
技术介绍
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23，β-D-半乳糖苷半乳糖基水解酶)属于糖苷水解酶家族，具有催化非还原末端β-D-半乳糖苷之间的糖苷键水解和转半乳糖苷的功能。目前主要应用于食品、医药、分析等领域。乳糖是一种二糖，由一分子半乳糖和一分子葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成。乳糖主要存在于乳制品中，牛奶中含有4.5％左右的乳糖。成人由于肠道中由于缺乏β-半乳糖苷酶活性而不能消化乳糖。肠道微生物能够发酵乳糖而引起腹胀、腹痛和腹泻等一系列症状，称为乳糖不耐症。使用β-半乳糖苷酶处理乳制品，能够将乳糖水解成人体能够吸收的半乳糖和葡萄糖，从而消除乳糖不耐症状。β-半乳糖苷酶在动物、植物和微生物中均有存在。微生物β-半乳糖苷酶具有产酶量大、性质多样、成本低等优点，在乳品加工中应用广泛。目前已知的β-半乳糖苷酶根据氨基酸序列同源性主要分布在糖苷水解酶GH1、GH2、GH35、GH42、GH59和GH147家族中。70％-80％的乳糖被水解的牛奶即可称为低乳糖牛奶，可有效解决乳糖不耐症问题。与中温和高温β-半乳糖苷酶相比，低温β-半乳糖苷酶能够在低温下水解乳糖，避免了由于加热而导致的牛奶品质下降，最大限度保持牛奶风味、热敏成分、降低微生物污染风险，从而节约资源，降低生产成本。同时在乳品加工中，低温水解乳糖能够避免浓缩时的结晶现象，改善乳品品质，提升反应速率和发酵效率，因而具有一定优势。目前用于乳品加工的商业化β-半乳糖苷酶大多为中温β-半乳糖苷酶，在冷藏温度时活性很低，如帝斯曼中性β-半乳糖苷酶(MaxilactLG2000)最适温度为37℃，水解率最高作用温度为43℃，低于37℃水解能力较差。因此，发掘新型低温中性β-半乳糖苷酶有十分重要的现实意义。乳清是奶酪生产的副产物，其中含有大量的乳糖(约44-52g/L)。乳清中的乳糖被β-半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖后，甜味有所增加，可替代蔗糖和和玉米糖浆作为食品和饮料工业中的甜味剂。因此，通过β-半乳糖苷酶水解乳清中乳糖生产甜味剂，可以实现乳清的高值利用。沙质微泡菌(Microbulbiferarenaceous)是一类革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)Microbulbiferaceae科。目前尚未见微泡菌属(Microbulbifer)β-半乳糖苷酶的报道和专利。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种沙质微泡菌β-半乳糖苷酶及其编码基因与应用。第一方面，本专利技术首先提供了蛋白质，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列2自N端第19至795位所示的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；A4)将A1)或A2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。所述蛋白质来源于沙质微泡菌(Microbulbiferarenaceous)。所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。所述融合蛋白质具体可为序列表的序列4所示的蛋白质。本专利技术还保护编码所述蛋白质的基因。所述基因为如下B1)-B5)任一所示：B1)序列表中序列1所示的DNA分子；B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；B3)序列表中序列1自5’端第55至2388位所示的DNA分子；B4)编码序列是序列表中序列1自5’端第55至2388位所示的DNA分子；B5)在严格条件下与B1)或B2)或B3)或B4)限定的DNA分子杂交，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。编码序列4所示的融合蛋白质的基因如序列表的序列3所示。本专利技术还保护含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-28a(+)载体的NheI和XhoI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。所述重组菌具体可为将上述重组表达载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到的重组菌。第二方面，本专利技术还保护上述蛋白质在作为β-半乳糖苷酶中的应用。第三方面，本专利技术还保护上述基因或重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备β-半乳糖苷酶中的应用。第四方面，本专利技术还保护上述基因或重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的应用，为如下(C1)-(C6)中的至少一种：(C1)水解乳糖；(C2)水解牛奶中的乳糖；(C3)水解乳清中的乳糖；(C4)制备低乳糖或无乳糖制品；(C5)制备低乳糖或无乳糖牛奶；(C6)利用乳清生产甜味剂。第五方面，本专利技术还保护制备β-半乳糖苷酶的方法，包括将上述基因导入到受体微生物中，得到表达β-半乳糖苷酶的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到β-半乳糖苷酶。上述方法中，所述受体微生物为原核微生物。具体的，所述原核微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌Rosetta(DE3)。上述方法中，所述基因可以通过含有所述基因的重组表达载体导入到受体微生物中。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列1自5’端第55-2388位所示的DNA片段替代pET-28a(+)载体的NheI和XhoI酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。本专利技术还保护上述方法制备得到的β-半乳糖苷酶。所述β-半乳糖苷酶最适pH为6.5，在pH5.5–7.5保温30min，残余酶活力在80％以上；最适温度为30℃，在30℃以下保持稳定。第六方面，本专利技术还保护水解乳糖的方法，包括如下步骤：采用上述蛋白质或上述方法制备得到的β-半乳糖苷酶对样品中的乳糖进行水解。上述方法中，所述样品具体可为牛奶或乳清。上述方法中，所述水解体系中所述蛋白质或β-半乳糖苷酶的浓度可为1U/mL-5U/mL。具体可为1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL或5U/mL。上述方法中，所述水解反应的温度具体可为冷藏温度(具体为4℃)或者室温(具体为20-25℃)。上述方法中，所述水解的时间具体可为0-84h。更具体可为4h、8h、24本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：/nA1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；/nA2)氨基酸序列是序列2自N端第19至795位所示的蛋白质；/nA3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；/nA4)将A1)或A2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白质，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列2自N端第19至795位所示的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A4)将A1)或A2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。


2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下B1)-B5)任一所示：
B1)序列表中序列1所示的DNA分子；
B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
B3)序列表中序列1自5’端第55至2388位所示的DNA分子；
B4)编码序列是序列表中序列1自5’端第55至2388位所示的DNA分子；
B5)在严格条件下与B1)或B2)或B3)或B4)限定的DNA分子杂交，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。


4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。


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【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，姚宇晨，温永平，刘瑜，孙健，闫巧娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11