高活性β-半乳糖苷酶、高通量筛选该酶的质粒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种高活性β‑半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者SEQ ID NO：2所示序列经消除、取代、添加一个或多个氨基酸的衍生氨基酸序列；编码该高活性β‑半乳糖苷酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示，或者SEQ ID NO：1所示序列经消除、取代、添加一个或多个碱基且能够编码相同功能β‑半乳糖苷酶的基因序列。本发明专利技术SEQ ID NO：2所示氨基酸序列及衍生氨基酸序列的β‑半乳糖苷酶具有高的酶活性，同时采用本发明专利技术的包含SEQ ID NO：1和panARS基因的游离型质粒可用于β‑半乳糖苷酶工程菌高通量筛选；通过高通量筛选能够快速获得工程菌，缩短菌株培养周期。

High activity \u03b2 - galactosidase, high throughput screening of plasmids for the enzyme and its preparation

【技术实现步骤摘要】
高活性β-半乳糖苷酶、高通量筛选该酶的质粒及其制备方法
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及β-半乳糖苷酶，以及涉及用于高通量筛选具有β-半乳糖苷酶活性的游离型质粒，和该质粒的制备方法。
技术介绍
乳糖酶(lactase)，又称作β-半乳糖苷酶，能够催化β—半乳糖苷化合物中β—半乳糖苷键发生水解，将人体内过多的乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，解决乳糖不耐受患者食用乳制品的问题。再者，乳糖酶还可在人体内通过转糖苷作用生成低聚糖，这些低聚糖是一种低分子量、不粘稠的水溶性膳食纤维，可大大减少肠道有害毒素的产生，对预防便秘和腹泻有很重要的作用。绝大多数用于重组蛋白表达的载体都是整合到巴斯德毕赤酵母基因组中，整合型表达的优势主要表现为稳定性好，但缺点也十分明显，如相对较低的转化效率、蛋白质生产的一定程度的异质性、非特异性整合和胁迫条件下多拷贝整合的遗传不稳定性。游离型表达具有更简单的方案和更高的转化效率。游离型质粒转化毕赤酵母可以使目的基因的拷贝数显著增加，此外对菌体基因组的影响相对较小，对菌体本身的生长和代谢造成不利影响的几率较低。随着高通量工作的不断发展，已经挖掘出可用于穿梭质粒的自主复制序列(ARS)。ARS首次被发现是在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，被确定可以作为游离质粒能够自主复制的基因组序列。基因组ARS序列，被认为是起源于有丝分裂期间的DNA复制。已经发现在巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母基因组上，功能上与ARS序列相似的序列(PARS和panARS)。含有这种自主复制序列的环状质粒都可以高效转化到酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母中。迄今为止，毕赤酵母采用游离型质粒表达异源蛋白的报导非常少见，因此开发能够在毕赤酵母中稳定高效表达的游离型质粒具有重要意义。易错PCR技术构建随机突变文库，是定向进化研究最早采用的一种方式。易错PCR技术主要通过增加PCR体系中Mg2+浓度、添加Mn2+采用低保真性的Taq酶和调整4种dNTP的含量等方式引入随机突变。该技术最早是由Leung等人提出，其关键步骤在于控制突变频率，突变频率太高或太低都无法获得令人满意的突变库，此外一般情况下，仅一轮易错的突变筛选往往不能获得满意的结果，需进行连续易错PCR加高通量筛选。建立一种高通量筛选的方法是快速获得可应用于工业生产的重组工程菌的关键。高通量筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以96孔板、微板或芯片形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的实验仪器检测实验数据，从而在短时间内对数以千、万计的样品进行测试。要实现高通量筛选，则需要将传统的菌种培养转变为微型化培养，采用特定的底物显色反应平板初筛或者流式细胞技术等加快筛选效率。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供高酶活的β-半乳糖苷酶。本专利技术的另一目的是提供用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒。本专利技术的再一目的是提供上述游离型质粒的制备方法。本专利技术的技术方案是提供一种高活性β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或者SEQIDNO：2所示序列经消除、取代、添加一个或多个氨基酸且具备与SEQIDNO：2代表的β-半乳糖苷酶相同功能的衍生氨基酸序列；SEQIDNO：2所示序列中X代表20种氨基酸中的任意一种。上述编码高活性β-半乳糖苷酶的基因序列(lac0基因)如SEQIDNO：1所示，或者SEQIDNO：1所示序列经消除、取代、添加一个或多个碱基且能够编码相同功能β-半乳糖苷酶的基因序列。SEQIDNO：1所示序列的NCBI登录号为FM955406。本专利技术还提供用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒，其包含如SEQIDNO：1和SEQIDNO：3所示的序列。本专利技术进一步提供用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒的制备方法，包括以下步骤：(1)构建含有自主复制序列的游离型质粒(parsGAPzαA)合成panARS基因序列(SEQIDNO：3)，将其克隆到puc57克隆载体上；酶切puc57-ARS和pGAPzαA，连接载体和目的基因(panARS)；转化连接产物到top10感受态中，用菌落PCR和酶切进行筛选验证；验证正确的克隆进行测序验证，将验证正确的重组载体命名为parsGAPzαA；(2)构建β-半乳糖苷酶重组表达载体(parsGAPzαA-lac0)将构建的parsGAPzαA和带有酸性乳糖酶基因(即lac0基因，序列如SEQIDNO：1所示)的pPIC9K-lac0双酶切，连接载体和lac基因，转化top10；用菌落PCR和双酶切验证的方法进行筛选验证，将验证正确的重组载体命名为parsGAPzαA-lac0；(3)β-半乳糖苷酶重组表达载体下游克隆位点校正设计定点突变引物，以parsGAPzαA-lac0为模板，进行全质粒PCR，将3’端的酶切位点校正为KpnI；PCR产物用DpnI酶处理去除质粒模板，纯化后化转到top10中；挑取转化子，进行双酶切验证，验证正确后送测序进行进一步确认；(4)构建β-半乳糖苷酶毕赤酵母表达菌的随机突变文库以parsGAPzαA-lac0为模板，做易错PCR扩增lac0基因的三段序列(上游、中游和下游)，回收易错PCR产物；再以易错PCR的三段产物为大引物，以parsGAPzαA-lac0为模板做MegaWhopPCR扩增全长质粒，得到的产物经DpnI酶消化原始质粒模板，纯化后直接转化大肠杆菌；挑取若干个克隆子送测序，检测突变率，保证碱基突变个数在1-3之间；待所有条件全部符合后，混合菌液提取突变体质粒，电转化毕赤酵母GS115、X33、SMD1168和KM71；(5)高通量筛选具有β-半乳糖苷酶活性的重组菌转化后的菌液涂布到含有Zeocin和1‰X-gal的YPD平板；28℃培养2-3天；观察平板显色情况；挑取显色深的菌落进入深孔板培养发酵，最终通过酶活检测筛选出酶活较高的重组菌株；筛选得到的具有高酶活的潜力菌株。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术SEQIDNO：2所示氨基酸序列及衍生氨基酸序列的β-半乳糖苷酶具有高的酶活性，同时采用本专利技术的游离型质粒可用于β-半乳糖苷酶工程菌高通量筛选；通过高通量筛选能够快速获得工程菌，缩短菌株培养周期，有利于工业上大规模推广应用，对于提高β-半乳糖苷酶的产量具有有益影响。附图说明图1为β-半乳糖苷酶游离型重组表达载体的质粒图谱。图2为深孔板筛选中几株酶活力较高的β-半乳糖苷酶的突变菌和对照菌(lac基因)发酵不同时间的酶活结果。图3a和图3b为易错质粒(有随机突变的parsGAPzαA-lac0)电转毕赤酵母后在x-gal显色平板上的结果。图4为MEGAWHOPPCR(大引物PCR)结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高活性β-半乳糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者SEQ IDNO：2所示序列经消除、取代、添加一个或多个氨基酸且具备与SEQ ID NO：2代表的β-半乳糖苷酶相同功能的衍生氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.高活性β-半乳糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或者SEQIDNO：2所示序列经消除、取代、添加一个或多个氨基酸且具备与SEQIDNO：2代表的β-半乳糖苷酶相同功能的衍生氨基酸序列。


2.用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒，其特征在于，包含如SEQIDNO：1和SEQIDNO：3所示的序列。


3.用于表达高活性β-半乳糖苷酶的宿主细胞，其特征在于，包含如SEQIDNO：1和SEQIDNO：3所示的序列。


4.用于高通量筛选高活性β-半乳糖苷酶的游离型质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有自主复制序列的游离型质粒
合成panARS基因序列，即SEQIDNO：3所示序列，将其克隆到puc57克隆载体上；酶切puc57-ARS和pGAPzαA，连接载体和目的基因panARS；转化连接产物到top10感受态中，用菌落PCR和酶切进行筛选验证；验证正确的克隆进行测序验证，将验证正确的重组载体命名为parsGAPzαA；
(2)构建β-半乳糖苷酶重组表达载体
将构建的parsGAPzαA和lac0基因的pPIC9K-lac0双酶切，连接载体和lac0基因，转化top10；用菌落PCR和双酶切验证的方法进行筛选验证，将验证正确的重组载体命名为parsGAPzαA-lac0；其中lac0基因的序列如SEQIDNO：1所示；
(3)构建β-半乳糖苷酶毕赤酵母表达菌的随机突变文库

【专利技术属性】
技术研发人员：林丽春，田健，张东风，诸辉，
申请(专利权)人：宁波希诺亚海洋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33