本发明专利技术提供了一种定点突变改造的β‑半乳糖苷酶，属于基因工程领域。本发明专利技术的β‑gal突变体是由野生型β‑gal的氨基酸序列基础上，发生第229位Ala突变为Cys。并将该突变酶转化到大肠杆菌，进行异源表达。相较于野生酶，突变酶的酶活力提高了1倍左右。β‑gal进行定点突变改造后，暴露在蛋白质表面的巯基，与修饰巯基的磁纳米颗粒之间，通过巯基‑二巯基交换反应，完成酶的共价固定化。
【技术实现步骤摘要】
一种定点突变改造的β-半乳糖苷酶及其构造方法
本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种定点突变改造的β-半乳糖苷酶及其构造方法与应用。
技术介绍
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal,EC3.2.1.23)常简称为乳糖酶,广泛存在于各种动物、植物及微生物中,是一种重要的具有生理病理作用的水解酶。其主要生理功能是催化水解糖苷键,将乳糖转化成半乳糖,在维持正常的生命活动中具有举足轻重的作用，β-gal活性及含量的异常通常与癌症的发生有着密切的关系。在生物化学分析中，通常依据β-gal可催化ONPG水解生成ONP，后者在405nm处有最大吸收峰的原理，用酶促反应后405nm吸光度的增加值(减去对照的吸光度值)检测β-gal活性的高低。此外，FDG被认为是可用于检测β-gal的最敏感的荧光底物之一。无色和非荧光的FDG水解成高荧光荧光素，具有出色的光谱特性(Ex/Em＝492/520nm)，与大多数荧光仪器的最佳检测窗口相匹配。β-gal催化的FDG水解之后可以在520nm附近荧光增加。通过荧光强度即可测定β-gal的活性。目前，已有研究表明，通过巯基-二巯基交换反应可成功实现酶的定点固定化。巯基-二巯基交换反应是酶偶联反应的一种，是指带-SH或-S-的载体，通过巯基-二巯基的交换反应和酶分子上非必需巯基偶联。通过溶剂可及性计算可知该β-gal第613位Cys，暴露在蛋白质表面，与β-gal的相关性质密不可分，且Cys具有还原性，极易被氧化，故该Cys中的巯基并不是酶分子上非必需巯基。如此，我们尝试通过定点突变技术，完成巯基-二巯基交换反应。定点突变技术是在已知的核苷酸序列中准确改变一个或多个碱基，从而改变组成蛋白质的一个或多个氨基酸残基，以研究蛋白质结构和功能的关系。定点突变技术在基因工程改造中发挥着巨大作用，在提高酶活，改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。通过定点突变技术将蛋白质表面的一个或多个氨基酸残基突变为Cys，从而通过巯基-二巯基交换反应来实现酶的定点固定化，已有应用(J.R.Simonsa,M.Mosischb,A.E.Tordab,L.Hilterhausa,*.JournalofBiotechnology167(2013)1–7)。但针对β-gal表面氨基酸突变为Cys并通过巯基-二巯基交换反应完成酶的固定化，至今未有应用。基于以上背景，本专利技术拟公开一种定点突变改造的β-gal及其构造方法与应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过定点突变技术，将β-gal的一个或多个氨基酸残基突变为Cys，从而通过巯基-二巯基交换反应将其固定在修饰了巯基的磁纳米颗粒上，来实现酶的定点固定化。作为本专利技术的第一个方面，提供了一种β-gal突变体，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。作为本专利技术的第二个方面，还提供了编码上述突变体的基因。作为本专利技术的第三个方面，还提供了一种重组质粒载体，该重组质粒载体含有上述基因。本专利技术还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含上述基因或上述重组质粒载体，此构成本专利技术的第四个方面。优选的，所述宿主细胞为E.coliBL21。作为本专利技术的第五个方面，还提供了上述β-gal突变体的构建方法，包括如下步骤：(1)构建包含所述β-gal的编码基因的重组质粒载体，所述重组质粒载体以大肠杆菌为宿主；(2)以所述步骤(1)中的重组载体为模板，利用如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的引物对，通过反向PCR扩增得到包含有SEQIDNo.2所示的碱基序列的PCR产物，即环状质粒；(3)将所述环状质粒转化至宿主细胞即E.coliBL21，获得含有β-gal突变体基因工程菌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：相比野生酶，本专利技术的突变酶的酶活力提高了1倍左右，β-gal进行定点突变改造后，暴露在蛋白质表面的巯基，与修饰了巯基的磁纳米颗粒之间，通过巯基-二巯基交换反应，成功完成了酶的固定化。附图说明：图1为改造前后的β-gal的SDS-PAGE分析，其中M：蛋白Marker；1：亲和纯化的WTβ-gal；2：亲和纯化的β-gal-A229C；图2为WTβ-gal和β-gal-A229C与底物FDG反应后的荧光光谱图图3为WTβ-gal(右)和β-gal-A229C(左)分别与与载体PuriMagSi-SH结合后与底物FDG反应后的溶液颜色改变图。具体实施方式实施例1β-gal突变体的制备(1)构建重组质粒pET-28a(+)-β-gal：编码野生型的β-gal(氨基酸序列SEQIDNo.3所示)的基因的重组载体。首先根据原始氨基酸序列(GenBank:AF184246)以乳酸菌表达宿主进行密码子优化合成基因，得到经优化后的β-gal编码基因(核苷酸序列如SEQIDNo.4所示)，将上述β-gal编码基因和pET-28a(+)载体分别使用BamHI和Xhol酶进行双酶切，然后分别进行回收，用T4DNA连接酶将回收后的编码基因片段和pET-28a(+)载体进行连接，得到重组质粒载体pET-28a(+)-β-gal，将重组质粒载体转化至克隆宿主E.coliTOP10。对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQIDNo.4相同)，挑选测序正确的菌株，并提取重组质粒载体。(2)构建重组质粒质粒pET-28a(+)-β-gal-A229C：含有β-gal突变体的编码基因的重组质粒载体。以重组质粒pET-28a(+)-β-gal为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物对(如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示)，利用试剂盒反向PCR扩增得到包含有突变基因的碱基序列的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后利用DNA限制性内切酶Dpnl消化非目的产物，再将质粒转入E.coliDH5α，涂布于含有卡那霉素抗性的固体LB培养基上37℃培养。挑取培养基上的单菌落进行测序验证，得到验证正确的转化子。(3)基因工程菌的构建：含有β-gal突变基因工程菌从E.coliDH5α提取质粒，将其转化到E.coliBL21，涂布于含有卡那霉素抗性的固体LB培养基上37℃培养。挑取培养基上的单菌落进行测序验证，验证正确的转化子为含有β-gal突变基因工程菌。实施例2含有本专利技术β-gal突变基因工程菌的表达和酶活性(1)基因工程菌的表达纯化：将上述含有β-gal突变基因工程菌进行扩大培养并诱导表达，诱导温度为10℃、诱导时间为13-14h、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.1mM，将诱导后的菌液在4℃8000r/min下离心5min，收集菌液，用pH7.5的磷酸盐缓冲液重悬菌体并采用超声波细胞破碎仪进行菌体破碎，在4℃8000r/min下离心20min，所得上清即为粗酶用于以下纯化。吸取Ni-IDA填料1mL于层析柱中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种β-gal突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种β-gal突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.一种重组质粒载体，其特征在于：该重组质粒载体含有权利要求2所述的基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞含有权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒载体。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为E.coliBL21。
...
【专利技术属性】
技术研发人员：盖宏伟，金潇婷，张业旺，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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