一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶及其应用。所述琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有相同酶活性的，由此所衍生的酶。本发明专利技术的琼胶酶能够容受甲基化半乳糖，对于甲基化的琼脂糖结构片段以及经典的琼脂糖结构片段均具有高效的催化能力；相比于普通的琼胶酶能更完全的降解琼胶，提高其生物利用率。通过控制加酶量或反应时间等条件，可快速降解琼脂糖生成分子量为6kDa‑900kDa的不同分子量琼脂糖及寡糖。

【技术实现步骤摘要】
一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶及其应用。
技术介绍
琼胶是从海洋红藻细胞壁中提取的多糖，是一种重要的海洋多糖。琼脂糖是琼胶的主要组分，具有优良的凝胶特性，广泛地应用于食品及食品相关工业、化妆品、药品等行业。琼脂糖由(1-3)-O-β-d-吡喃半乳糖残基(G残基)及(1-4)-O-3,6-内醚-α-l-吡喃半乳糖残基(LA残基)交替组成。多项研究表明，琼脂糖的结构具有高度异质性，其结构中的G残基往往被甲基化修饰，且修饰程度高达20％。琼脂糖在室温下不易溶解，生物利用率低。由琼脂糖降解得到的低分子琼脂糖以及寡糖具有水溶性好、粘度低、生物利用率高的特点，并且具有抗菌、保湿皮肤、黑色素瘤细胞增白、抗肥胖、抗糖尿病等多种生物活性，是潜在的功能食品因子，在食品、医药行业中展现出良好的应用前景。糖苷水解酶能特异性的切割琼脂糖主链中的糖苷键并且不改变其天然结构中的取代基。与常用的酸解相比，采用酶降解琼脂糖不仅反应条件温和，绿色环保，能耗低，并且具有酶的高效性与底物专一性的特点，可有效的克服酸解存在的条件难控制、产物不均一、产物分析和回收难等问题。琼胶酶是一类可特异性降解琼胶中的琼脂糖组分，生成琼脂寡糖的水解酶，根据酶切位点不同，琼胶酶可被分为α-琼胶酶和β-琼胶酶，分别切割α-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键。糖苷水解酶的高度特异性以及多糖结构的异质性，意味着多糖的完全转化需要特异性不同的水解酶。目前已被表征的传统的琼胶酶特异性强，只能降解经典的琼胶结构片段，即(LA-G)n，而无法降解含有甲基的多糖片段。因此，这些琼胶酶无法完全降解含甲基的天然琼脂糖。寻找能够容受甲基化半乳糖的琼胶酶对于提高琼脂糖的生物利用率与转化率至关重要。在目前的研究报道中，仅有一个来自Pseudomonasatlantica的野生型琼胶酶能水解甲基化的琼脂糖，但野生酶需要在琼脂糖的诱导下才可产生，且其制备成本高、纯化难度大，且产酶总量低、活力低，难以用于工业的大规模生产应用中。分子克隆可以依据基因实现酶的高效表达及大量获取，是解决以上问题的理想策略。实现产酶序列的克隆表达可为酶法降解琼脂糖提供工具，为低分子量琼脂糖及寡糖的大规模生产应用提供前提。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题为野生型容受甲基化半乳糖的琼胶酶产量低、活力低、纯化难度大，产酶菌株需在琼脂糖底物的诱导下才可产酶，致使酶的制备成本高、缺少完全转化琼脂糖的关键工具酶。为解决上述问题，本专利技术从WenyingzhuangiafucanilyticaCZ1127T菌株中发掘得到一条基因，其原始核苷酸编码735个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，利用ExPASy软件预测其理论分子量为79.73kDa。根据序列比对发现此酶与目前报道的同家族的琼胶酶的相似性最高仅为47％，所以此酶为一种序列新颖的酶。以此为基础提供一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶的基因及其应用，从而突破该类酶的高效获取及实际应用、琼脂糖的完全转化、低分子量琼脂糖及寡糖规模化制备的关键瓶颈。为达到上述目的，本专利技术提供一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶，其氨基酸序列为SEQIDNO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。SEQIDNO.1：MRVKSVYKKLSVSFILVMLSASQEVNSQAKVSVNLNVKHVVGGISEFDRTKYITIHANQIENEWDGDNFTSDLRDHFLNGFDVYLGRDTGGITWNLNNMQEDASRPGFANPSNIISKGINTRNNYASKTHLHVYENRKSNHVVAAQLHPFWTGESQIATKGTGWELASPTATGEYMGRYFNEFYGGNGEPVPSWIEVINEPAYEALGGKKNFTNSLQEIADFHVEVADAIRVQNPNLKIGGYTAAFPDFETGDFQRWINRDKLFIDVAGEKMDFWSWHLYDFPVIGGKEDIRSGSNVEATFDMHDHYSMLKLGHKKPYVISEYGAQTHDFRNEGWSSYRDWLFVRAQNSLMMSFMERPEDIAMAIPFTIVKAEWGFNTDKNLPYPARLMRKANEPESYTGEWVYTDRVKFYDLWKNVKGTRIDTKSTDLDIQVDAYVDGNKGYLILNNLESEETEITLDVFEKYDSSITNILKRHLTLSSNNVVIEEETFSSSISTVQLGAGSTMILEYTFANSLTIDETSTEEKYYADSYLQPIVASQPILFAVNNVVKSATYGEAVLRLGLGRDHGKSLKPIVKVNNTEVVVPDDWRGYDQADKGRFFGTIEIPVSYDLLTTNNTVSVEFPDSSGHVSSVIMQVFNFSSDIRTLSVNDVTASDTKTLLISPNPVKDGMLNMTIPAKLKNPIASIYNVSGSLLIKQSMKHSQTSIPVNLFDKGVYLLVLQDGSKKIGESKFVIQ该酶与其他已知酶的序列相似度最高仅为47％(与来源于Saccharophagusdegradans2-40产Aga86C相似度最高)，为一种序列新颖的酶。利用MEGA6将该酶与CAZy数据库中的GH86家族已性质研究的序列构建系统发育树，结果如图6所示：可以看出该酶处于GH86家族琼胶酶的系统发育树中。因此，本专利技术中的琼胶酶是GH86家族的一个新成员。一种编码上述容受甲基化半乳糖的琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.2及可翻译出SEQIDNO.1的所有基因。SEQIDNO.2：ATGAGGGTTAAATCTGTATATAAAAAACTTAGTGTGAGTTTTATTTTAGTAATGCTATCTGCTTCTCAAGAGGTAAATAGTCAAGCTAAAGTTTCTGTTAATTTAAATGTAAAACACGTTGTTGGTGGGATATCTGAATTTGATAGAACAAAGTATATCACAATTCATGCAAATCAAATTGAAAATGAGTGGGATGGTGATAATTTTACATCAGATTTAAGAGATCATTTTTTAAATGGCTTTGATGTATATTTAGGAAGAGATACAGGAGGGATTACTTGGAATTTAAATAATATGCAAGAAGATGCTTCTAGACCTGGTTTTGCAAATCCTTCTAACATAATATCAAAAGGTATAAACACTAGAAATAATTATGCTTCTAAAACGCATTTACATGTATATGAAAATAGAAAAAGCAATCATGTAGTCGCAGCACAATTACATCCGTTTTGGACAGGTGAAAGTCAAATAGCTACTAAAGGTACAGGTTGGGAATTGGCAAGTCCAACTGCAACTGGAGAATATATGGGACGTTATTTTAATGAATTTTATGGAGGTAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有此酶活性的，由此所衍生的酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种容受甲基化半乳糖的琼胶酶，其氨基酸序列为SEQIDNO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有此酶活性的，由此所衍生的酶。


2.编码权利要求1中琼胶酶对应的基因，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示及可翻译出SEQIDNO.1的所有序列。


3.包含SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。


4.一种表达琼胶酶的重组质粒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：常耀光，曹斯琦，张玉莹，薛长湖，申晶晶，王玉明，薛勇，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37