靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法技术

本发明专利技术公开了靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，包括基础集成板、输入机构和输出机构，基础集成板上固定连接有把手，输入机构和输出机构通过支架安装在基础集成板上，输入机构和输出机构之间安装有张紧轮，同步带和张紧轮之间通过齿形带同步转动，本发明专利技术通过同步锁紧或旋松子阵锁紧螺钉，保证子阵在安装过程中不会因过于倾斜而卡住，不产生附加力，可以实现将雷达子阵在导轨间隙小、插拔力大的情况下安全有效安装到位，亦适用于维修更换时拆出，提升了雷达子阵的安装成功率和效率，亦可提升雷达子阵维修效率，该靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法同时具备易操作，效率高，重量轻，便于携带，耐用，可靠性高的特点。

【技术实现步骤摘要】
靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法
本专利技术涉及耐药骨肉瘤治疗
，具体是靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法。
技术介绍
骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常见的侵袭性原发性恶性骨肿瘤，多发生于儿童和青年人。目前，治疗骨肉瘤的金标准为：首先使用综合化疗，然后进行肿瘤的根治性切除(如果情况允许也可切除转移瘤)，然后再次进行综合化疗。非转移性骨肉瘤患者的5年生存率为70％，而转移性或复发性骨肉瘤患者的5年生存率仅约为20％。然而，这种综合治疗策略在骨肉瘤患者中的有效比例仍不超过60％。尽管有不同的治疗策略，骨肉瘤的预后在过去的几十年中并没有得到明显的改善。目前治疗效果有限的主要原因是由于对化疗药物的耐药。肿瘤耐药的产生的原因包括：肿瘤细胞过表达ATP结合盒式转运蛋白，如P-糖蛋白(P-gP)，这是一种细胞膜上三磷酸腺苷(ATP)依赖的单向外排泵，可将抗癌药物排出胞外；长期的化疗药物选择之后出现了对相应化疗药物产生耐受能力的细胞克隆。因此，迫切需要针对新的治疗靶点研发新的疗法，以逆转肿瘤的耐药性。近年来，线粒体作为有效的肿瘤治疗靶点受到了广泛关注。线粒体是细胞的能量工厂，是一种不可或缺的亚细胞器，每个细胞有数百到数千个，在细胞的各种生理过程中起着至关重要的作用，包括启动内源性凋亡途径。线粒体功能改变是肿瘤发生、发展，血管生成及化疗药物耐药的重要标志。通过诱导线粒体凋亡，可释放细胞色素c，进而激活caspase级联。因此，通过线粒体靶向诱导肿瘤细胞凋亡在治疗恶性肿瘤方面具有巨大的潜力。以光动力疗法(PDT)联合光热疗法(PTT)为代表的协同光疗可用于治疗耐药肿瘤，由于作用机制的不同，其治疗效果优于化疗。协同光疗是一种无创、高选择性、低全身毒性的肿瘤治疗方法。在光疗中，光照被光敏剂(PS)或光热剂吸收，并转化为活性氧(ROS)或局部高热，进而导致肿瘤细胞死亡。利用其光诱发性，通过合理的联合PDT及PTT，可协同促进肿瘤治疗。然而，如果PDT及PTT的激发光谱不匹配，照射过程中可能需要连续两次照射，因此增加了治疗的时间及复杂性。此外，一些固有的缺陷，如ROS的寿命较短(10ns–320ns)和扩散半径较局限(10nm–55nm)会降低PDT的治疗效果。因此，使用单剂照射，在某些对ROS敏感的细胞器中诱导产生ROS，可能是一种有前途的治疗策略。报道表明，在所有细胞器中，线粒体对ROS和高温介导的损伤最为敏感，可迅速扰乱线粒体功能，改变线粒体膜电位，减少ATP生成，最终诱导肿瘤细胞凋亡。因此，通过光疗选择性在线粒体产生ROS和高热可以显著提高它们的治疗效果。此外，热疗结合ROS介导线粒体功能障碍，同时抑制ATP生成应是克服肿瘤耐药性的一种有效策略。因此，线粒体靶向协同光疗可作为耐药骨肉瘤治疗的替代策略。因此，选择性、高效性促进光敏剂及光热剂在线粒体聚集，将光束精确聚焦于肿瘤区域，通过单剂近红外光同时激发，将光能充分地转化为热能并生成ROS至关重要。因此，在光疗过程中，需要实时勾勒出肿瘤边缘，将其与正常组织区分开来，从而使光束能准确聚焦在肿瘤区域。研究表明，在700nm–900nm波长范围内的近红外(NIR)区域的荧光(FL)成像可用于实时监测光敏剂和光热剂在体内的动态分布，以及检测肿瘤及其边缘。此外，为了提高治疗效率，减少操作步骤和治疗所需时间，并充分利用PDT和PTT的协同作用，光敏剂和光热剂须以复合结构的形式同时递送到线粒体，并使用单剂NIR进行激发。因此，协同光疗有赖于光敏剂和光热剂的吸收光谱相重叠。然而，这种特殊的要求和复杂的合成工艺有可能限制其进一步的应用。因此，开发一种简单、高效的纳米复合物协同进行PDT和PTT，具有重大需求。吲哚菁绿(ICG)是美国FDA批准的近红外造影剂，不仅可以用于近红外荧光成像，还可以将光能转换为热能并生成ROS，实现协同光疗。因此，ICG被认为是肿瘤治疗的理想药物之一。然而，ICG在肿瘤治疗中的应用存在以下几个缺点：i)体内半衰期短；ii)由于其亲水性强，细胞摄取能力差；iii)可能被P-gP单向排出；iv)缺乏肿瘤特异性聚集；v)肿瘤光疗效率较低，需与其他治疗策略结合以改善治疗结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，线粒体靶向氧化石墨烯纳米复合物用于荧光成像引导下的协同光疗治疗耐药骨肉瘤，包括如下步骤：(1)、实验细胞、动物及肿瘤异种移植，将MG63/Dox细胞植于小鼠背部皮下，然后用荷瘤小鼠进行活体成像和光疗，(2)、PPG、TPP-PPG和TPP-PPG@ICG制备，(3)、表征，对TPP-PPG、ICG和TPP-PPG@ICG的光学特性采用紫外可见近红外分光光度计进行表征，(4)、单线态氧检测，用单线态氧绿色荧光探针检测单线态氧的生成，(5)、光热转换实验，用近红外光进行照射，使用红外线温度计记录温度变化，(6)、细胞摄取和细胞内定位，将MG63/Dox细胞培养孵育后，用PBS洗涤后在培养基中重悬，流式细胞仪检测样品的平均荧光强度，将MG63/Dox细胞与TPP-PPG@ICG共同培养，PBS洗涤细胞后加入线粒体荧光探针孵育,对线粒体进行标记，PBS再次洗涤细胞后用激光扫描共聚焦显微镜扫描获取图像，(7)、体外实验，将MG63/Dox细胞悬液培养加入不同浓度的ICG、TPP-PPG和PPG@ICG溶液，对非照射组PBS洗涤后再次培养，照射组使用808nmNIR照射后再次培养，检测细胞活力同时进行活细胞/死细胞双染，将MG63/Dox细胞加入PBS、TPP-PPG@ICG、ICG、TPP-PPG、PPG@ICG及TPP-PPG@ICG培养，加入双染试剂盒孵育，使用近红外荧光光谱进行观察，(8)、细胞凋亡和胞内ROS检测，MG63/Dox细胞培养NIR照射后低速离心收集细胞，在缓冲液中重新悬浮避光染色后，低速离心收集细胞，PBS洗涤并用结合缓冲液稀释后进行流式细胞分析，用DCFH-DA试剂盒检测细胞内ROS的产生，(9)、线粒体膜电位检测，用JC-1记录线粒体膜电位的变化，用激光共聚焦显微镜采集图像，(10)线粒体超氧化物检测，使用线粒体超氧化物荧光探针检测线粒体超氧化物的产生，(11)、ATP检测，使用ATP检测试剂盒绘制ATP浓度标准曲线，(12)、近红外荧光及热学成像，对MG63/Dox荷瘤裸鼠尾静脉注射TPP-PPG@ICG，采用近红外成像系统进行体外近红外成像，使用NRI进行照射时使用红外热成像相机对小鼠肿瘤组织温度变化进行实时成像，(13)、体内PDT/PTT联合治疗，将荷瘤小鼠随机分为6组，PBS非照射组(对照组)、TPP-PPG@ICG非照射组、ICG照射组、TPP-PPG照射组、PPG@ICG照射组和TPP-PPG@ICG照射组，静脉注射ICG，照射组在肿瘤部位使用808nmNIR进行照射，持续15天，收集肿瘤和主要器本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，线粒体靶向氧化石墨烯纳米复合物用于荧光成像引导下的协同光疗治疗耐药骨肉瘤，其特征在于，包括如下步骤：(1)、实验细胞、动物及肿瘤异种移植，将MG63/Dox细胞植于小鼠背部皮下，然后用荷瘤小鼠进行活体成像和光疗，(2)、PPG、TPP-PPG和TPP-PPG@ICG制备，(3)、表征，对TPP-PPG、ICG和TPP-PPG@ICG的光学特性采用紫外可见近红外分光光度计进行表征，(4)、单线态氧检测，用单线态氧绿色荧光探针检测单线态氧的生成，(5)、光热转换实验，用近红外光进行照射，使用红外线温度计记录温度变化，(6)、细胞摄取和细胞内定位，将MG63/Dox细胞培养孵育后，用PBS洗涤后在培养基中重悬，流式细胞仪检测样品的平均荧光强度，将MG63/Dox细胞与TPP-PPG@ICG共同培养，PBS洗涤细胞后加入线粒体荧光探针孵育,对线粒体进行标记，PBS再次洗涤细胞后用激光扫描共聚焦显微镜扫描获取图像，(7)、体外实验，将MG63/Dox细胞悬液培养加入不同浓度的ICG、TPP-PPG和PPG@ICG溶液，对非照射组PBS洗涤后再次培养，照射组使用808nm NIR照射后再次培养，检测细胞活力同时进行活细胞/死细胞双染，将MG63/Dox细胞加入PBS、TPP-PPG@ICG、ICG、TPP-PPG、PPG@ICG及TPP-PPG@ICG培养，加入双染试剂盒孵育，使用近红外荧光光谱进行观察，(8)、细胞凋亡和胞内ROS检测，MG63/Dox细胞培养NIR照射后低速离心收集细胞，在缓冲液中重新悬浮避光染色后，低速离心收集细胞，PBS洗涤并用结合缓冲液稀释后进行流式细胞分析，用DCFH-DA试剂盒检测细胞内ROS的产生，(9)、线粒体膜电位检测，用JC-1记录线粒体膜电位的变化，用激光共聚焦显微镜采集图像，(10)线粒体超氧化物检测，使用线粒体超氧化物荧光探针检测线粒体超氧化物的产生，(11)、ATP检测，使用ATP检测试剂盒绘制ATP浓度标准曲线，(12)、近红外荧光及热学成像，对MG63/Dox荷瘤裸鼠尾静脉注射TPP-PPG@ICG，采用近红外成像系统进行体外近红外成像，使用NRI进行照射时使用红外热成像相机对小鼠肿瘤组织温度变化进行实时成像，(13)、体内PDT/PTT联合治疗，将荷瘤小鼠随机分为6组，PBS非照射组(对照组)、TPP-PPG@ICG非照射组、ICG照射组、TPP-PPG照射组、PPG@ICG照射组和TPP-PPG@ICG照射组，静脉注射ICG，照射组在肿瘤部位使用808nmNIR进行照射，持续15天，收集肿瘤和主要器官，获取的内脏进行苏木精-伊红染色，并进行显微镜观察。/n...

【技术特征摘要】
1.靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，线粒体靶向氧化石墨烯纳米复合物用于荧光成像引导下的协同光疗治疗耐药骨肉瘤，其特征在于，包括如下步骤：(1)、实验细胞、动物及肿瘤异种移植，将MG63/Dox细胞植于小鼠背部皮下，然后用荷瘤小鼠进行活体成像和光疗，(2)、PPG、TPP-PPG和TPP-PPG@ICG制备，(3)、表征，对TPP-PPG、ICG和TPP-PPG@ICG的光学特性采用紫外可见近红外分光光度计进行表征，(4)、单线态氧检测，用单线态氧绿色荧光探针检测单线态氧的生成，(5)、光热转换实验，用近红外光进行照射，使用红外线温度计记录温度变化，(6)、细胞摄取和细胞内定位，将MG63/Dox细胞培养孵育后，用PBS洗涤后在培养基中重悬，流式细胞仪检测样品的平均荧光强度，将MG63/Dox细胞与TPP-PPG@ICG共同培养，PBS洗涤细胞后加入线粒体荧光探针孵育,对线粒体进行标记，PBS再次洗涤细胞后用激光扫描共聚焦显微镜扫描获取图像，(7)、体外实验，将MG63/Dox细胞悬液培养加入不同浓度的ICG、TPP-PPG和PPG@ICG溶液，对非照射组PBS洗涤后再次培养，照射组使用808nmNIR照射后再次培养，检测细胞活力同时进行活细胞/死细胞双染，将MG63/Dox细胞加入PBS、TPP-PPG@ICG、ICG、TPP-PPG、PPG@ICG及TPP-PPG@ICG培养，加入双染试剂盒孵育，使用近红外荧光光谱进行观察，(8)、细胞凋亡和胞内ROS检测，MG63/Dox细胞培养NIR照射后低速离心收集细胞，在缓冲液中重新悬浮避光染色后，低速离心收集细胞，PBS洗涤并用结合缓冲液稀释后进行流式细胞分析，用DCFH-DA试剂盒检测细胞内ROS的产生，(9)、线粒体膜电位检测，用JC-1记录线粒体膜电位的变化，用激光共聚焦显微镜采集图像，(10)线粒体超氧化物检测，使用线粒体超氧化物荧光探针检测线粒体超氧化物的产生，(11)、ATP检测，使用ATP检测试剂盒绘制ATP浓度标准曲线，(12)、近红外荧光及热学成像，对MG63/Dox荷瘤裸鼠尾静脉注射TPP-PPG@ICG，采用近红外成像系统进行体外近红外成像，使用NRI进行照射时使用红外热成像相机对小鼠肿瘤组织温度变化进行实时成像，(13)、体内PDT/PTT联合治疗，将荷瘤小鼠随机分为6组，PBS非照射组(对照组)、TPP-PPG@ICG非照射组、ICG照射组、TPP-PPG照射组、PPG@ICG照射组和TPP-PPG@ICG照射组，静脉注射ICG，照射组在肿瘤部位使用808nmNIR进行照射，持续15天，收集肿瘤和主要器官，获取的内脏进行苏木精-伊红染色，并进行显微镜观察。


2.根据权利要求1所述的靶向氧化石墨烯复合物用于治疗耐药骨肉瘤的实验方法，其特征在于，所述步骤(1)中MG63/Dox细胞混于100μL基质凝胶中进行移植，肿瘤体积达到60mm3时，进行活体...

【专利技术属性】
技术研发人员：余秋萍，周宗科，曾伟南，王端，于浩达，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51