本发明专利技术公开了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D‑二聚体的试剂盒，包括反应缓冲液和胶乳试剂；所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂。还公开了该试剂盒的制备方法：首先筛选出至少两株特异性、活性较强的DD单抗，将单抗各自与胶乳微球偶联制取胶乳试剂，然后按照一定的比例混合混匀即得到DD胶乳试剂，在保持灵敏度情况下特异性也较强；再配制反应缓冲液；最后将胶乳试剂和反应缓冲液组成试剂盒，用于检测DD的含量；通过该制备方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求。
【技术实现步骤摘要】
基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及生物检测实际制备领域，特别是涉及一种基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
二聚体(D-dimer，DD)是交联纤维蛋白特异的降解产物，它的生成或增高反映了凝血或纤溶系统的激活，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一，广泛应用于血栓性疾病有关的临床诊断中。血浆D二聚体测定是了解继发性纤维蛋白溶解功能的一个试验。检查原理：抗D-D单克隆抗体包被于胶乳颗粒上，受体血浆中如果存在D-二聚体，将产生抗原-抗体反应，乳胶颗粒发生聚集现象。但是，凡有血块形成的出血，本试验均可呈阳性，故其特异性低，敏感度高。测定纤溶系统主要因子，对于诊断与治疗纤溶系统疾病(如DIC，各种血栓)及与纤溶系统有关疾病(如肿瘤，妊娠综合症)，以及溶栓治疗监测，有着重要的意义。纤维蛋白降解产物D的水平升高，表明体内存在着频繁的纤维蛋白降解过程。因此，纤维D-二聚体是深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、弥漫性血管内凝血(DIC)的关键指标。近年来，随着方法学的不断进步，DD检测的方法也越来越多，但利用的核心原理均是免疫检测，应用较多的DD检测方法主要有：酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶颗粒凝集试验(LATEX)、免疫过滤胶体金染色法、双抗体RBC凝集法和放免法。临床最常用是：ELISA、LATEX和免疫过滤胶体金染色法，其中LATEX法测定速度快，但敏感度不如ELISA法；ELISA法敏感度高，但检测时耗时较长。由于不同的检测方法其灵敏度不同，其正常参考值随检测方法的不同而不同，且随年龄的增长而有所增高。其中胶乳免疫比浊法是近年逐渐在全自动血凝仪上开始使用的方法，因其使用方便、操作简单、定量准确、检测快速等优点逐渐在各大中型医院中推广使用。在胶乳增强免疫比浊法应用中，采用多抗进行标记可以有效提高试剂灵敏度，但会造成特异性不强，使检测结果准确度下降；而采用一株单抗对胶乳进行标记可以使特异性提高，但灵敏度又会受到影响。因此亟需提供一种新型的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的方法来解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒及其制备方法，能够解决现有市场上流通的检测D-二聚体的灵敏度低和线性范围小的缺点，可以使用全自动生化分析仪检测D-二聚体，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，包括反应缓冲液和胶乳试剂；其中，所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂。在本专利技术一个较佳实施例中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液中的任一种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述无机盐包括氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述增浊剂包括聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或几种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述防腐剂包括Proclin300或硫柳汞中的任一种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述稳定剂包括BSA或蔗糖中的任一种。在本专利技术一个较佳实施例中，所述胶乳微球的粒径范围为100—300nm。为解决上述技术问题，本专利技术采用的另一个技术方案是：提供一种基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)清洗：量取固含为10％的胶乳微粒，加至2.5ml—5ml清洗缓冲液中，20000转/分钟离心30min，去上清，用活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；(2)活化：量取活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，胶乳微粒与活化剂的重量比例为：1：10—1：20，混匀，对胶乳微粒进行活化0.5h；(3)偶联：取至少两珠经筛选好的特异性强的单抗各自与活化好的胶乳微粒进行偶联，时间为2小时，胶乳微粒与抗体的质量比例为10:1—10:5；(4)封闭：偶联时间结束后开始20000转/分钟离心30min，去上清，取2.5ml—5ml封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭1h；(5)定溶：封闭结束后开始20000转/分钟离心30min，去上清，加入10ml—20ml胶乳保存液对胶乳微粒进行重悬超声，然后定溶；(6)混合：将两珠定溶好的标记有单抗的胶乳微粒按照体积比2:1—4:1的比例混合混匀，得到DD胶乳试剂，置于2—8℃保存；(7)称取缓冲液、无机盐、增浊剂，防腐剂、稳定剂，制得反应缓冲液，并将反应缓冲液和DD胶乳试剂组成用于测定D-二聚体含量的试剂盒。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤(1)中，所用清洗缓冲液为磷酸盐缓冲液；所用活化缓冲液为磷酸盐缓冲液。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤(2)中，所述活化剂为EDAC/NHS。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤(4)中，所述封闭缓冲液包括BSA、甘氨酸中的一种或几种。在本专利技术一个较佳实施例中，在步骤(5)中，所述胶乳保存液包括缓冲液，稳定剂，防腐剂和表面活性剂；其中，所述稳定剂包括BSA，蔗糖，甘露醇中一种或几种；所述防腐剂包括Proclin300或硫柳汞中一种或几种；所述表面活性剂包括吐温-20，吐温-80，曲拉通X-100中的一种或几种。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术首先筛选出至少两株特异性、活性较强的DD单抗，将单抗各自与胶乳微球偶联制取胶乳试剂，然后按照一定的比例混合混匀即得到DD胶乳试剂，在保持灵敏度情况下特异性也较强；再配制反应缓冲液；最后将胶乳试剂和反应缓冲液组成试剂盒，用于检测DD的含量；(2)通过本专利技术所述制备方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求；(3)本专利技术旨在解决现有市场上流通的检测D-二聚体的灵敏度低和线性范围小的缺点，可以使用全自动生化分析仪检测D-二聚体，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好，并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市场前景。附图说明图1是本专利技术基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒的拟合曲线图。具体实施方式下面对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例1：一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，包括反应缓冲液和胶乳试剂；其中，所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂，即所述胶乳试本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲液和胶乳试剂；其中，所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲液和胶乳试剂；其中，所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂。
2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液中的任一种。
3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述无机盐包括氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述增浊剂包括聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂包括Proclin300或硫柳汞中的任一种。
6.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括BSA或蔗糖中的任一种。
7.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球的粒径范围为100—300nm。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)清洗：量取固含为10％的胶乳微粒，加至2...
【专利技术属性】
技术研发人员：芮双印，李祥宇，
申请(专利权)人：安徽大千生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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