一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用，为从复杂的生物样品体系中发现小分子结合靶标的化学蛋白质组学方法靶点响应性可及性变化谱技术（TRAP），在包含目标小分子作用靶标的生物样本（如细胞裂解液）中，利用化学标记试剂共价修饰蛋白中特定活性氨基酸（如赖氨酸），在终止标记过程后，利用定量蛋白质组学技术，比较生物样本在缺乏及存在孵育的小分子时其中全蛋白组水平各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋白位点的可及性变化，根据变化的倍数及显著性筛选孵育小分子配体导致化学可及性显著变化的位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜在结合和诱导变构的位点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用。
技术介绍
在新药的研究与开发中，药物靶标的明确至关重要。例如，来自于中药的天然产物尽管具有良好的药效和较低的毒性，但由于药理机制以及靶标分子不确定等原因限制了药物进入市场；对于现有上市药物，对其作用靶标的发现和确证能够有效指导针对新发现的功能靶标进行候选分子的结构设计和优化，推进新药研发进程；对于针对已知靶标进行的纯蛋白水平的药物筛选所获得的候选化合物是否能够在真实的细胞、组织等复杂生物体系中结合其靶标也是决定其临床效果的重要指标。因此，随着新药研发领域对药物作用机制阐述要求的不断提高，小分子靶标发现是亟待革新的技术瓶颈。小分子靶标发现一直是个热门且棘手的问题。经典的靶标发现手段如亲和纯化色谱，通过固定小分子配体于固相基质上，在与含有靶标的细胞裂解液等孵育后，对富集到的蛋白进行鉴定即可获得初步的靶标信息。然而该方法过程繁琐，依赖于对目标化合物的固定化，可能会干扰其与靶蛋白的相互作用的，难以获得真实生理环境下与小分子配体产生相互作用的靶标蛋白。此后兴起的基于化学蛋白质组学技术的蛋白质活性谱技术(ABPP，Activity-basedproteinprofiling)，则通过修饰目标小分子配体为化学探针，在保留小分子参与靶标亲和作用的功能结构的基础上添加点击反应基团和共价结合靶蛋白的官能团，再对与探针结合的蛋白进行分析，发现靶标。由于此方法需要基于配体小分子结构逐个进行探针设计，必须以构象关系为探针设计的理论基础，合成实验过程繁杂、周期长、通量低，难以作为普适性的小分子靶标发现技术进行推广。因此，不对目标化合物进行修饰的靶标发现策略应运而生，例如药物亲和反应靶点稳定性技术(DARTS，drugaffinityresponsivetargetstability)、细胞热稳定分析法(CETSA，cellularthermalshiftassay)、氧化蛋白稳定性技术(SPROX，stabilityofproteinsfromratesofoxidation)等等，这些方法都是基于定量蛋白质组学技术，考察配体结合前后靶蛋白对水解酶、热变性、有机溶剂变性条件下蛋白稳定性的改变，从而筛选受配体结合影响稳定性的蛋白为靶标，然而这一类方法通常需要配体与靶标结合后诱导出稳定和显著的构象变化，对含量较高的靶标蛋白质的筛选效果好，不适合低丰度蛋白、弱结合蛋白或结合不改变聚集和变构过程的靶标蛋白，并且无法提供小分子与靶标的结合位点信息。
技术实现思路
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用，创新性地建立了一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标发现技术TargetResponsiveAccessibilityProfiling(TRAP)。其原理是靶标蛋白的高级结构在与小分子配体结合后，其配体结合域及诱导变构区域的氨基酸残基的溶剂可及性会发生显著变化；该变化能够被还原烷基化等化学共价标记反应所捕捉，再利用定量蛋白质组学手段对细胞内的全蛋白组进行分析，能够获得真实生物体系内小分子孵育后全体蛋白组的可及性变化信息，从中筛选出小分子诱导可及性变化最显著的蛋白即为小分子靶标，这为阐述药物及内源性代谢物等活性分子对细胞的调控机制奠定了基础。本方法采用了针对蛋白质中活性赖氨基酸的共价修饰反应，其标记效率高，定量结果可靠，操作便捷，成本低廉，且质谱数据信息的后期分析简单方便，并且能够结合高通量定量蛋白质组学流程，实现高效、快速的靶标发现。综上所述，本专利技术开发的是一种既能够实现在复杂的生物体系中发现药物等小分子靶标蛋白的技术，通过直接测定小分子结合诱导的靶标蛋白可及性变化筛选出靶标及结合位点，能够普适性的运用于多个小分子配体的高通量靶标发现。该专利技术对于目前无晶体结构的蛋白也能提供适量的配体结合位点的信息，并且适用于与小分子存在弱结合的靶标发现研究，能够反映出小分子与靶标在真实的细胞等生理环境中实际发生的结合构象。本专利技术不仅可以获得真实生物体系内小分子的结合靶标谱，还能获得小分子与靶标的结合或诱导的变构位点的信息，是阐述药物及内源性代谢物等活性分子对细胞调控机制的分子基础。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：第一方面，提供一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法，所述的小分子靶标筛选方法基于靶点响应性可及性变化谱技术(TRAP)，包括：(1)共价标记：在包含目标小分子作用靶标的生物样本中，利用化学标记试剂共价修饰生物样本蛋白中特定活性氨基酸；(2)在终止标记过程后，利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较生物样本在缺乏以及存在孵育小分子配体时其中全蛋白组水平各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋白位点的可及性变化；根据变化的倍数及显著性筛选孵育小分子配体导致生物样本中蛋白化学可及性显著变化的位点，将所述位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜在结合和诱导变构的位点。所述的活性氨基酸指具有化学活性基团的氨基酸，包含但不限于赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等。用于标记活性赖氨酸的化学标记试剂为氟苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、磺化NHS、丙烯酸磺酰酯、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、酰亚胺酯、琥珀酸酐、醋酸酐、马来酸酐、2-乙酰苯基硼酸、磺酰卤、环氧化物、氟苯、吲哚及吲哚衍生物、酰基叠氮化物中的一种，或为醛基化合物与还原剂的组合；所述醛基化合物包括甲醛、乙醛、丙醛；还原剂包括硼烷-吡啶络合物(BPC)、硼氢化钠、二甲胺硼烷(DMAB)。优选的，在一些实施例中，用于标记活性赖氨酸的标记试剂包括但不限于本专利技术实施例使用的甲醛和硼烷-吡啶络合物(BPC)，为了区分内源性甲基化修饰，在生物体系中采用氘代甲醛进行标记；在重组蛋白体系，对于0.1mg/mL的纯蛋白溶液采用终浓度为1-5mM的氘代甲醛和0.5-3mM的BPC，而在复杂的生物样本体系，对于3mg/mL的细胞裂解液采用终浓度为5-15mM的氘代甲醛和2-8mM浓度的BPC进行标记，但不局限于该比例。针对活性氨基酸进行标记反应的试剂可以采用除了甲醛和BPC的其他共价标记试剂，例如活性酯类包括氟苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、磺化NHS、丙烯酸磺酰酯、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、酰亚胺酯，酸酐类包括琥珀酸酐、醋酸酐、马来酸酐，其他类型化学试剂包括2-乙酰苯基硼酸、磺酰卤、环氧化物、氟苯、吲哚及吲哚衍生物、酰基叠氮化物等。。对蛋白进行共价标记后，采用的定量蛋白质组学流程的方案灵活，所述的定量蛋白质组学技术采用非标定量法或多通道标记定量法，多通道标记定量法包括串联质谱标签TMT定量蛋白组学、相对及绝对定量等重标签iTRAQ定量蛋白组学。第二方面，提供所述的小分子靶标筛选方法在筛选小分子靶标中的应用。本专利技术建立了基于定量蛋白质组学结果筛选与小分子配体结合后化学可及性发生显著变化的靶蛋白及位点，能够广泛的应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的小分子靶标筛选方法基于靶点响应性可及性变化谱技术，包括：/n（1）共价标记：在包含目标小分子作用靶标的生物样本中，利用化学标记试剂共价修饰生物样本蛋白中特定活性氨基酸；/n（2）在终止标记过程后，利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较生物样本在缺乏以及存在孵育小分子配体时其中全蛋白组水平各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋白位点的可及性变化；根据变化的倍数及显著性筛选孵育小分子配体导致生物样本中蛋白化学可及性显著变化的位点，将所述位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜在结合和诱导变构的位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的小分子靶标筛选方法基于靶点响应性可及性变化谱技术，包括：
（1）共价标记：在包含目标小分子作用靶标的生物样本中，利用化学标记试剂共价修饰生物样本蛋白中特定活性氨基酸；
（2）在终止标记过程后，利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较生物样本在缺乏以及存在孵育小分子配体时其中全蛋白组水平各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋白位点的可及性变化；根据变化的倍数及显著性筛选孵育小分子配体导致生物样本中蛋白化学可及性显著变化的位点，将所述位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜在结合和诱导变构的位点。


2.根据权利要求1所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的活性氨基酸为具有化学活性基团的氨基酸，包含赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。


3.根据权利要求2所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的活性氨基酸优选为赖氨酸。


4.根据权利要求3所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，用于标记活性赖氨酸的化学标记试剂为氟苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、磺化NHS、丙烯酸磺酰酯、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、酰亚胺酯、琥珀酸酐、醋酸酐、马来酸酐、2-乙酰苯基硼酸、磺酰卤、环氧化物、氟苯、吲哚及吲哚衍生物、酰基叠氮化物中的一种，或为醛基化合物与还原剂的组合；
所述醛基化合物包括甲醛、乙醛、丙醛；还原剂包括硼烷-吡啶络合物、硼氢化钠、二甲胺硼烷。


5.根据权利要求4所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述甲醛采用氘代甲醛。


6.根据权利要求5所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，氘代甲醛与包含目标小分子作用靶标的生物样品蛋白中特定活性氨基酸的摩尔比为5:1-15:1，更优选为10:1。


7.根据权利要求1所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的定量蛋白质组学技术采用非标定量法...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝海平，叶慧，皖宁，田扬，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32