AKT新底物HIP-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了AKT新底物HIP‑55的磷酸化抗体产品制备方法与应用。本发明专利技术提供了一种制备HIP‑55蛋白S269或T291位点磷酸化抗体的方法，包括如下步骤：以抗原合成肽作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述HIP‑55蛋白S269或T291位点磷酸化抗体；所述抗原合成肽为在半抗原合成肽的N端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，且对应HIP‑55蛋白的S269或T291位点修饰有磷酸基团。本发明专利技术HIP‑55磷酸化抗体具有很好的敏感性和特异性，可用于检测HIP‑55与AKT互作，进而用于辅助诊断心肌梗死。

【技术实现步骤摘要】
AKT新底物HIP-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及AKT新底物HIP-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用。
技术介绍
自首次发现以来，丝氨酸/苏氨酸激酶AKT(又称作蛋白激酶B或PKB)作为一种原癌基因，已经成为医学界主要的关注热点，这是因为它在调控各种不同生理或者病理功能(包括代谢、生长、增殖、存活、转录以及蛋白质合成)方面发挥重要作用。AKT主要通过调控其各种底物发挥重要的生理或者病理功能。如AKT通过直接磷酸化AKT底物p21和p27，进而调控细胞周期进程；AKT通过直接磷酸化促凋亡蛋白Bad或转录因子FoxO，而产生抑制凋亡信号，促进细胞存活；AKT通过激活底物AS160对调节生物体糖代谢发挥重要作用。由于AKT通过调节其不同底物蛋白进而调节各种细胞功能，并在众多生物学进程中都扮演着重要角色，这使得调控AKT和/或其底物蛋白成为人类疾病治疗的重要靶标。HIP-55(hematopoieticprogenitorkinase1[HPK1]-interactingproteinof55kDa；也称为drebrin-likeproteinDBNL、mAbp1或SH3P7)是一个包含多功能域的蛋白质。其结构主要包含着N端的F-actin蛋白结合结构域和C端SH3结构域。目前对于HIP-55的蛋白性质了解不多，还没有研究表明HIP-55与AKT之间的关系。更没有HIP-55磷酸化抗体的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供AKT新底物HIP-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用。第一方面，本专利技术要求保护一种制备HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体的方法。本专利技术要求保护的制备HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体的方法，可包括如下步骤：以抗原合成肽A作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体。所述抗原合成肽A为在半抗原合成肽A的C端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽A的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，第6位氨基酸残基S修饰有磷酸基团。第二方面，本专利技术要求保护一种制备HIP-55蛋白T291位点磷酸化抗体的方法。本专利技术要求保护的制备HIP-55蛋白T291位点磷酸化抗体的方法，可包括如下步骤：以抗原合成肽B作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述HIP-55蛋白T291位点磷酸化抗体。所述抗原合成肽B为在半抗原合成肽B的N端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽B的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，第7位氨基酸残基T修饰有磷酸基团。在第一方面和第二方面中，所述动物均可为兔子(如日本大耳兔)。所述载体蛋白均可为血蓝蛋白(KLH)。第三方面，本专利技术要求保护HIP-55蛋白磷酸化抗体。本专利技术要求保护的HIP-55蛋白磷酸化抗体，可为如下任一：(A1)利用前文第一方面中所述方法制备得到的HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体；(A2)利用前文第二方面中所述方法制备得到的HIP-55蛋白T291位点磷酸化抗体。第四方面，本专利技术要求保护一种抗原合成肽。本专利技术要求保护的抗原合成肽，可为如下任一：(B1)前文第一方面中所述的抗原合成肽A；(B2)前文第二方面中所述的抗原合成肽B。第五方面，本专利技术要求保护前文第四方面中所述抗原合成肽在制备前文第三方面中所述HIP-55蛋白磷酸化抗体中的应用。第六方面，本专利技术要求保护前文第三方面中所述HIP-55蛋白磷酸化抗体在检测HIP-55蛋白S269位点和/或T291位点磷酸化状态中的应用。其中，所述HIP-55蛋白S269位点和/或T291位点磷酸化状态可为HIP-55蛋白S269位点和/或T291位点是否发生磷酸化，也可为其磷酸化水平的高低。第七方面，本专利技术要求保护前文第三方面中所述HIP-55蛋白磷酸化抗体在检测检测HIP-55蛋白与AKT互作中的应用。第八方面，本专利技术要求保护HIP-55蛋白在如下任一中的应用：(C1)作为AKT底物；(C2)与AKT互作。所述(C1)-所述(C2)是依赖于HIP-55蛋白S269位点和/或T291位点发生磷酸化来实现的。第九方面，本专利技术要求保护前文第三方面中所述HIP-55蛋白磷酸化抗体在制备用于诊断或者辅助诊断心肌梗死的产品中的应用。其中，所述产品可为试剂盒。在本专利技术的具体实施方式中，所述HIP-55蛋白的氨基酸序列具体为SEQIDNo.3。相应的，所述能够翻译成所述HIP-55蛋白的DNA(即DBNL基因)的核苷酸序列具体为SEQIDNo.4。实验证明，本专利技术制备的HIP-55蛋白S269/T291位点磷酸化抗体具有很好的敏感性和特异性，可用于检测HIP-55蛋白S269/T291位点磷酸化状态。本专利技术还发现与HIP-55为AKT的底物，本专利技术HIP-55蛋白S269/T291位点磷酸化抗体可用于检测HIP-55与AKT的互作，进而用于辅助诊断心肌梗死。附图说明图1为重组载体pRP.EX3d–αMHC>hDBNL(WT)/flag>hrGFP的质粒图谱。图2为HIP-55的S269位点和T291位点的特异性磷酸化抗体的效价图。A为HIP-55的S269位点特异性磷酸化抗体能够识别HIP-55第269位丝氨酸(S269)磷酸化的多肽序列，但不识别无磷酸化的多肽序列，且抗体效价>1:200000。B为HIP-55的T291位点特异性磷酸化抗体能够识别HIP-55第291位苏氨酸(T291)磷酸化的多肽序列，但不识别无磷酸化的多肽序列，且抗体效价>1:200000。图3为HIP-55的S269位点和T291位点的特异性磷酸化抗体的检测。A为HIP-55S269磷酸化抗体的敏感性与特异性。B为HIP-55T291磷酸化抗体的敏感性与特异性。C为HIP-55S269及T291磷酸化抗体的特异性。D为当给予EGF刺激后，分别利用HIP-55S269磷酸化抗体及HIP-55T291磷酸化抗体能够正确识别出HIP-55磷酸化水平，同时HIP-55S269磷酸化抗体及HIP-55T291磷酸化抗体不能够识别出GST-HIP-55AA(S269A/T291A)。图4为心肌梗死模型小鼠心脏组织中HIP-55的表达情况。A为mRNA表达水平；B为蛋白表达水平。图5为HIP-55敲除对心肌梗死损伤的影响。A为基因型鉴定HIP-55全身敲除鼠的证据。B为HIP-55全身敲除鼠的蛋白水平证据。C为TTC染色检测小鼠心肌梗死面积。D为TUNEL染色检测心肌梗死时心肌细胞凋亡。E为心肌梗死后心胫比。F为心脏超声。图6为心脏特异性HIP-55过表达对心肌梗死损伤的影响。A为基因型鉴定心脏特异性HIP-55过表达鼠的证据。B为心脏特异性HIP-55过表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体的方法，包括如下步骤：以抗原合成肽A作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体；/n所述抗原合成肽A为在半抗原合成肽A的C端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，第6位氨基酸残基S修饰有磷酸基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体的方法，包括如下步骤：以抗原合成肽A作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体；
所述抗原合成肽A为在半抗原合成肽A的C端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽A的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，第6位氨基酸残基S修饰有磷酸基团。


2.一种制备HIP-55蛋白T291位点磷酸化抗体的方法，包括如下步骤：以抗原合成肽B作为免疫原，免疫动物，收集抗血清，纯化后得所述HIP-55蛋白T291位点磷酸化抗体；
所述抗原合成肽B为在半抗原合成肽B的N端连接一个半胱氨酸后与载体蛋白进行偶联所得；所述半抗原合成肽B的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，第7位氨基酸残基T修饰有磷酸基团。


3.HIP-55蛋白磷酸化抗体，为如下任一：
(A1)利用权利要求1所述方法制备得到的HIP-55蛋白S269位点磷酸化抗体；
(A2)利用权利要求2所述方法制备得到的HIP-55蛋白T291位点磷酸化抗体。


4.抗原合成肽，为如下任一：
(...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子健，姜允奇，何丹，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：北京;11